复方红花饮对大鼠脑挫裂伤后血脑屏障通透性和SOD、MDA水平影响的实验研究*

别晓东李 敏虞 立杨洁红万海同张宇燕△

（1.浙江大学医学院附属第二医院，浙江 杭州 310009；2.浙江中医药大学，浙江 杭州310053）

复方红花饮对大鼠脑挫裂伤后血脑屏障通透性和SOD、MDA水平影响的实验研究*

别晓东1李 敏2虞 立2杨洁红2万海同2张宇燕2△

（1.浙江大学医学院附属第二医院，浙江 杭州 310009；2.浙江中医药大学，浙江 杭州310053）

目的通过大鼠脑挫裂伤后对血脑屏障通透性和SOD、MDA水平的影响，观察复方红花饮对大鼠脑挫裂伤的作用。方法 SD大鼠随机分为假手术组、模型组、治疗组（予复方红花饮），每组10只。采用自由落体打击法制备大鼠脑挫裂伤模型，观察各组在6 h、24 h、72 h、7 d不同时间点脑组织中EB含量、SOD活力和MDA含量。结果 治疗组在6 h、24 h、72 h能显著降低伊文思蓝含量，在6 h、24 h、72 h、7 d能显著升高SOD活力，在24 h、72 h、7 d能显著降低MDA含量，与模型组比较具有显著差异（P＜0.05或P＜0.01）。结论 复方红花饮对大鼠脑挫裂伤后具有抑制脑挫裂伤后血脑屏障的过度开放和明显抗氧化作用。

复方红花饮 脑挫裂伤 血脑屏障通透性 超氧化物歧化酶 丙二醛

脑挫伤和脑裂伤往往同时并存，合称脑挫裂伤。颅脑外伤患者中常见到急性硬膜下血肿，且多伴脑挫裂伤，两者均可继发脑水肿，在受损位置产生占位效应，压迫、推移周围脑组织，导致颅内压力升高，严重者可使中线结构移位，脑干受压，从而引发脑疝，造成严重后果［1-3］。复方红花饮是在历史悠久的疗效确切的古方通窍活血汤的基础上，通过临床诊治经验的进一步积累形成的中药配伍方药。复方红花饮是按照现代制剂工艺要求，提取藏红花、川芎、石菖蒲、水蛭、杜仲、生地黄等的主要活性成分后与药用辅料制备而成的复方制剂，通过前期临床治疗表明，对于脑创伤患者拥有明确的疗效，对脑继发性损害有独特的优势。为进一步探讨复方红花饮对脑挫裂伤的作用机制，同时可开发具有较好疗效的中药新药，本课题组开展了复方红花饮对大鼠脑挫裂伤后的作用及其机制的实验研究。

1 材料与方法

1.1 动物 健康清洁级SD大鼠，雄性，体质量（280± 10）g，购自浙江中医药大学动物实验研究中心，合格证：SYXK［沪］2013-016。

1.2 试药与仪器 复方红花饮（主要由红花6 g，川芎6 g，水蛭10 g，牛膝15 g，杜仲15 g，生地黄15 g等组成。按照处方组成和用量，在浙江中医药大学心脑血管病研究所提取制备成水煎浓缩液，相当于生药0.6 g/mL，并通过HPLC-DAD测定川芎嗪平均含量为0.37 mg/mL）；脑震宁颗粒：山西振东安特生物制药有限公司。伊文思蓝（Evan′s blue，Sigma进口分装），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所。UV-28系列紫外可见分光光度计（上海恒科仪器有限公司）；Micro17（R）/21（R）台式高速冷冻离心机（Thermo Fisher）。

1.3 分组与给药 SD大鼠随机分为假手术组、模型组、治疗组（予复方红花饮，按临床成人用量120 g生药计算，灌胃给药10.8 g生药/kg）。分别于造模成功后立即给药，每天1次，连续给药7 d。假手术组和模型组分别灌服给予等容积的生理盐水。假手术组10只，同时模型组和复方红花饮治疗组分设6 h、24 h、72 h、7 d等4个不同时间点组，每个时间点组10只。

1.4 模型制备 采用自由落体打击法制备大鼠脑挫裂伤模型［4-5］，大鼠称体质量后用 10%水合氯醛（0.4 mL/100 g体质量）腹腔注射麻醉。手术区剔除毛，碘伏（75%酒精）消毒，手术中使用电热板，并监测大鼠的肛温，维持在37℃左右，俯卧位固定大鼠。选取右侧颅顶旁正中切口，用电钻在矢状缝旁1.5 mm、冠状缝后1.5 mm向外后磨出直径约4 mm×6 mm的骨窗，用于放置撞击圆锥，并注意保持骨膜的完整性。之后采用改良的Feeney架自由落体撞击造成大鼠脑挫裂伤模型，将大鼠移至Feeney架击打平台，将击打垫片置于大鼠暴漏骨窗上，用20 g砝码置于距离颅骨35 cm高处自由落体击打垫片，对大鼠脑组织造成撞击，击打深度均为3～4 mm，不打穿硬脑膜。造成大鼠中等程度局灶性脑挫裂伤并昏迷。立即止血，封闭骨窗，双氧水、生理盐水冲洗创面后缝合，再用酒精擦洗伤口。假手术组除不击打外，其余操作方法均相同。手术后均立即用40 W白炽灯保暖，保持肛温37℃左右，一般1～2 h可以苏醒。苏醒后正常饲养，自由饮食。各组大鼠分别在6 h、24 h、72 h、7 d等不同时间点取损伤侧脑组织进行各项指标测定。

1.5 标本采集与检测 1）脑组织中伊文思蓝（EB）含量测定：在取脑组织手术前1 h股静脉注射2%EB 3 mL/kg，待大鼠眼球结膜、四肢皮肤均显示蓝色，表明注入成功。分别在规定时间点腹腔麻醉，迅速开胸，穿刺左心室后剪右心房一小口，用加抗凝剂（肝素钠）的生理盐水，直至右心房流出清亮液体，迅速断头取损伤侧半球脑组织，称湿质量后，置于已加有5 mL甲酰胺的离心管中，54℃恒温培养24 h，让组织中的EB充分溶解中甲酰胺溶液中，3000 r/min离心8 min，取上清液，用紫外可见分光光度计（635 nm）测定吸光度，根据线性回归方程计算溶液中EB含量。2）脑组织中SOD活力和MDA含量的测定：取损伤侧脑组织，称质量后按质量体积比加生理盐水制备成10%的组织匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清，-80℃冰箱保存，按试剂盒说明测定脑组织中SOD活力和MDA含量。

1.6 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件。计量资料以（）表示，单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 复方红花饮对大鼠脑挫裂伤后血脑屏障通透性的影响 见表1。大鼠脑挫裂伤后，损伤侧脑组织EB含量增高明显，6 h达到最高峰值，以后逐渐呈下降趋势，各不同时间点模型组与假手术组相比均具有显著差异（P＜0.01）。治疗组与模型组比较，在6、24、72 h均具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。表明复方红花饮具有降低大鼠脑挫裂伤后EB含量，抑制脑挫裂伤后血脑屏障的过度开放。

表1 各组大鼠脑挫裂伤后不同时间点EB含量比较（μg/g，）

表1 各组大鼠脑挫裂伤后不同时间点EB含量比较（μg/g，）

与假手术组同时间点比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；与模型组同时间点比较，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01。下同。

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2.2 复方红花饮对大鼠脑挫裂伤后SOD活力和MDA含量的影响 见表2，表3。大鼠脑挫裂伤6 h后，损伤侧脑组织SOD的活力显著降低，MDA含量显著升高，各不同时间点模型组与假手术组相比均具有显著差异（P＜0.01）。治疗组与模型组比较，在6 h、24 h、72 h、7 d不同时间点，SOD活力均显著高于模型组 （P＜0.01或P＜0.05），MDA含量在24 h、72 h、7 d不同时间点均显著低于模型组（P＜0.01）。表明复方红花饮可显著提高大鼠脑挫裂伤后SOD的活力，降低MDA含量，具有明显抗氧化作用。

表2 各组大鼠脑挫裂伤后SOD活力比较（U/mg，）

表2 各组大鼠脑挫裂伤后SOD活力比较（U/mg，）

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表3 各组大鼠脑挫裂伤后MDA含量比较（nmol/mg，）

表3 各组大鼠脑挫裂伤后MDA含量比较（nmol/mg，）

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3 讨 论

脑挫裂伤是头部外伤后脑组织发生的一系列器质性损伤，脑组织出现散在的小点状出血、撕裂、水肿及坏死，邻近部位常合并脑水肿、脑肿胀或不同程度的颅内血肿［6］。脑创伤后血脑屏障通透性增加在脑水肿的发生和发展过程中亦起着重要作用。血脑屏障通透性增高是严重颅脑损伤和实验性脑损伤的特征之一，在创伤性脑水肿的发生发展中起关键作用［7-8］，而脑组织中富含易受氧自由基攻击的磷脂和自由基生成过程中有催化作用的铁离子，使脑细胞对氧自由基的过氧化反应特别敏感，脑挫裂伤后引起氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化物，导致脑组织损伤［9］。本实验研究结果表明，大鼠脑挫裂伤后血脑屏障通透性在6 h后内达到高峰，然后逐渐降低；损伤侧脑组织SOD的活力显著降低，MDA含量显著升高，6 h、24 h、72 h、7 d内均与假手术组有显著差异。

复方红花饮主要是由红花、川芎、石菖蒲、水蛭、杜仲、生地黄等组成，通过临床诊治经验表明具有较好的治疗脑挫裂伤的疗效。方中，藏红花味甘性寒，具有较强的活血祛瘀作用，又兼有凉血解毒功效；川芎味辛性温，辛香走窜，主“中风入脑，头痛、寒痹痉挛”，功善活血行气，祛风止痛，为历代医家治头痛之要药；石菖蒲芳香开窍，水蛭苦咸，归肝经，破瘀血而不伤新血，具有通络止痛作用；杜仲、生地黄补肾生髓养脑。诸药合用祛瘀血、清邪热、补脑髓，达活血、开窍、泄热、补肾之功。

现代药理研究也表明，藏红花具有抗炎、抗肿瘤、降血脂等多种药理活性［10］，对缺血缺氧性及创伤性脑损伤具有明显的保护作用［11-12］。川芎中有效成分如川芎嗪等可改善微循环、降压；可通过镇痛，增加微循环的血液供应，提高脑组织对缺氧的耐受力，促进血肿吸收，降低颅内压，改善脑功能；抑制IL-8、IL-18、ICAM-1增加，降低脑水肿，改善神经功能缺损，抗神经细胞凋亡等［13-16］。石菖蒲提取物能明显减轻脑水肿，可能是其醒脑开窍作用的病理生理学基础［17］。水蛭体内的水蛭素、组胺样物质、肝素、抗血栓素等多种药用活性，对消除手术后引起的后遗症、阻碍血液凝固、促进血液循环有重要作用［18］。杜仲、生地黄等通过促进学习记忆、神经生长等多种途径，对脑损伤具有较好的保护作用［19-20］。

本实验研究结果也表明，治疗组饮与模型组相比，在6 h、24 h、72 h能显著降低EB含量，抑制脑挫裂伤后血脑屏障的过度开放，在6 h、24 h、72 h、7 d不同时间点显著升高SOD活力，在24 h、72 h、7 d不同时间点显著降低MDA含量，具有明显抗氧化作用。为临床治疗脑挫裂伤提供了思路，有助于开发具有确切疗效的中药新药，提高临床疗效。

［1］ López-Guerrero AL，Martínez-Lage JF，González-Tortosa J，et al.Pediatric crushing head injury：biomechanics and clinical features of an uncommon type of craniocerebral trauma［J］. Childs Nerv Syst，2012，28（12）：2033-2040.

［2］ Kazemi H，Hashemi-Fesharaki S，Razaghi S，et al.Intractable epilepsy and craniocerebral trauma：analysis of 163 patients with blunt and penetrating head injuries sustained in war［J］. Injury，2012，43（12）：2132-2135.

［3］ 熊南翔，张方成，赵洪洋，等.脑挫裂伤水肿转归时间的探讨［J］.中国临床神经外科杂志，2004，9（6）：427-429.

［4］ 刘建仁，黎启明，陈燕芬，等.大鼠脑挫裂伤模型的建立及损失机制的代谢组学分析［J］.广东医学，2014，35（14）：2148-2153.

［5］ 徐立新，刘运生，李玉斌，等.高温对大鼠重型脑挫裂伤的病理学影响［J］.中国现代手术学杂志，2005，9（1）：26-28.

［6］ Munoz-Sanchez MA，Murillo-Cabezas F，Cayuela-Dominguez A，et a1.Skull fracture，with or without clinical signs，in mTBI is an inde-pendent risk marker for neurosurgically relevant intracranial lesion：a cohort study［J］.Brmn Inj，2009，23（1）：39-44.

［7］ 刘林，方永奇.醒脑开窍中药对血脑屏障影响的研究进展［J］.中华中医药学刊，2010，28（8）：1726-1728.

［8］ 丁胜超，金永成，林贵军.大鼠脑挫裂伤半暗带水肿与血-脑屏障破坏的关系［J］.中国微侵袭神经外科杂志，2007，12（12）：548-551.

［9］ 程英，陈鑫.灯盏花素对大鼠脑挫裂伤脑组织线粒体ATP酶活性及SOD和MDA水平的影响［J］.上海中医药大学学报，2004，18（2）：58-60.

［10］Abe K，Saito H.Effects of saffron extract and its constituent crocin on learning behaviour and long-term potentiation［J］. Phy tother Res，2000，14：149-152.

［11］Zheng YQ，Liu JX，Wang JN，et al.Effects of crocin on reperfu-sion-induced oxidative/nitrative injury to cerebral microvessels after global cerebral ischemia［J］.Brain Res，2007，1138：86-94.

［12］霍军丽，甄海宁，刘卫平，等.藏红花素对小鼠创伤性脑损伤保护作用的研究［J］.现代生物医学进展，2013，13（109）：1892-1894.

［13］刘絮，姜秀文，王立英，等.川芎生物碱对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用［J］.北华大学学报：自然科学版，2016，17（3）：339-343.

［14］曹鉴萍，张志耘.川芎嗪影响脑血管疾病的作用机制及研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2006，8（2）：123-125.

［15］迟雪洁，孙蓉.川芎基于功效物质基础的抗脑缺血药理作用研究进展［J］.中国药物警戒，2013，10（6）：355-357.

［16］王万铁，徐正，陈寿权，等.川芎嗪注射液对脑缺血再灌注损伤家兔血清白细胞介素-8的影响［J］.中国中西医结合急救杂志，2000，7（6）：359-361.

［17］方永奇，李翎，邹衍衍，等.石菖蒲对缺血－再灌注脑损伤大鼠脑电图和脑水肿的影响［J］.中国中医急症，2003，12（1）：55-56.

［18］袁红霞，张莉芹，马瑾，等.水蛭药用成分及主要药理功效研究进展［J］.甘肃医药，2013，32（4）：270-273.

［19］邓江，王义为，张洁，等.杜仲提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究［J］.药物评价研究，2014，37（6）：498-501.

［20］黄勇，吴建军，刘凯，等.熟地含药血清对骨髓间质干细胞向神经细胞分化的影响［J］.中国老年学杂志，2011，31（20）：3979-3981.

Effect of the Compound of Safflower Drink on the Level of BBB Permeability，SOD and MDA in Rats after Brain Contusion

BIE Xiaodong，LI Min，YU Li，et al.The Second Affiliated Hospital of Medical College of Zhejiang University，Zhejiang，Hangzhou 310009，China.

Objective：To observe the effect of the compound of safflower drink against rats after brain contusion through the impact on the levels of blood-brain barrier permeability，SOD and MDA in rats after brain contusion.Methods：SD rats were randomly divided into the sham group，the brain contusion model group and the compound of safflower drink treated group.Each group had 10 rats.By adopting the method of free-fall combating the brain contusion model was established to observe EB content，SOD activity and MDA content in brain tissue at different time points of 6 h，24 h，72 h and 7 d.Results：The EB content at 6 h，24 h，72 h were significantly reduced and the SOD activity in 6 h，24 h，72 h，7 d were significantly increased；the MDA content at 24 h，72 h，7 d were significantly reduced in the compound of safflower drink treated group，which had significant difference compared with the model group（P＜0.01 or P＜0.05）.Conclusion：The compound of safflower drink has a significant anti-oxidant effect and can inhibit BBB excessive open after brain contusion in rats.

Compound of safflower drink；Brain contusion；BBB permeability；SOD；MDA

·研究报告·

浙江省中医药科技计划项目（2014ZA070）

△（电子邮箱：yannoo7376@sina.com）

R285.5

A

1004-745X（2016）11-2036-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.11.005

（2016-07-26）