维生素D对急性白血病多重耐药细胞的逆转耐药机制探讨①

樊 婷

(湖北省随州市中心医院，湖北 随州 441300)



维生素D对急性白血病多重耐药细胞的逆转耐药机制探讨①

樊 婷

(湖北省随州市中心医院，湖北 随州 441300)

目的：探讨维生素D对急性白血病多重耐药细胞的逆转耐药机制。方法:以MTT法获取无毒浓度维生素D，开展浓度依赖实验；经流式细胞仪监测细胞内柔红霉素以及P-糖蛋白(P-gp)表达水平；以实时荧光定量PCR(Real～time PCR)测定细胞内mdrl及mdpl mRNA表达变化；以生化法测定细胞内谷胱甘肽(GSH)水平。结果:维生素D可使耐药细胞耐药倍数下降，且有剂量依赖；维生素D干预Jurcat/ADR48h后，促使细胞内化疗药物浓度上升，抑制P-gP以及mdrl、mrpl基因的表达；维生素D使Jurcat与Jurcat/ADR细胞内GSH的水平显著降低。结论:维生素D对于Jurcat/ADR耐药逆转显著。维生素D参与抑制细胞表面的P-gp表达水平，抑制mdrl、mrpl mRNA表达及使细胞内GSH水平降低，间接提高细胞内的化疗药物浓度，实现对白血病的有效治疗。

维生素D； 白血病； 多重耐药

在目前白血病临床治疗中，联合化疗是最常见的治疗方案，能使白血病患者的生存期得以延长。然而，化疗过程中出现原发耐药患者约占15%～30%，经化疗后完全缓解的患者继发耐药约占60%～80%[1]，严重者甚至导致死亡。多重耐药(MDR)成为急性白血病化疗失败导致复发的首要原因[2]。传统化疗药干预MDR肿瘤细胞的临床效果不显著，导致化疗失败，急性白血病治疗也是如此[3]。本研究以维生素D对急性白血病细胞株进行耐药逆转研究，现总结如下。

1 材料与方法

1．1 材 料

1．1．1 细胞株及其培养:建立人急性T淋巴细胞白血病(ALL)耐药细胞株Jurcat/ADR。购自上海拜力生物科技有限公司的普通Jurcat细胞株。Jurcat/ADR细胞培养体系根据上海拜力生物科技有限公司的培养指标加入终质量浓度为0．5mg/L的多柔比星(doxorubicin，ADM)，进行为期2周的无药培养。

1．1．2 试剂:维生素D(上海抚生生物科技有限公司，批号：V9325，1g)；欧洲胎牛血清；注射用盐酸柔红霉素；RPMI 1640；鼠抗人P-gP单克隆抗体；cDNA第一链合成试剂盒、RNA提取试剂盒；GSH试剂盒；引物包括：mdrl上游引物5’-CCCAT-CATTGCAATAGCAGG-3’，下游引物为5’-GTFCAAACTTCTGCTCCTCA-3’，片段长157bp；mrpl上游引物为5’-GGACCTGGACTTCGTTCTCA-3’，rmpl下游引物5’-CGTC-CAGACTTCTTCATCCG-3’，片段长292bp。

1．2 方法:浓度依赖实验在采用MTT法筛选维生素D的无毒剂量，其抑制率不应大于10%的前提下，分为以下组：实验组：化疗药物柔红霉素(daunorubicin，DNR)、多柔比星(DOX)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside，Arac )、长春新碱(vincristine，VCR)联合维生素D，每个样本加注10ul维生素D维持其质量浓度分别达到10-3mg/L(A)、10-4mg/L(B)、10-5mg/L(C)、10-6mg/L (D)4个组。每组每孔均加入5ulADR(DNR、DOX、Arac、VCR)，保证其终质量浓度达到50ul/L。对照组：单纯化疗药物组(DNR、DOX、Arac、VCR)：细胞悬浮液加注75uL化疗药物。Jurcat及Jurcat/ADR加入10-3mg/L(A-s)、10-4mg/L(B-s)、10-5mg/L(C-s)、10-6mg/L(D-s)滴度的Vit D作为基线，对维生素D联合化疗药物对Jurcat及Jurcat/ADR的耐药状况进行参照。采用Real-time PCR检测mdrl mRNA、mrpl mRNA的表达情况，计算其相对表达量，每个实验设3个平行，结果取平均值。蛋白分析法检测GSH，计算各组细胞GSH含量，每个实验设3个平行，结果取平均值。

2 结 果

2．1 维生素D的耐药逆转及浓度依赖实验:伴随Vit D质量浓度的递增，Jurcat/ADR耐药倍数降低，推测维生素D逆转了Jurcat/ADR对DNR、DOX、Arac、VCR的耐药性(P<0．05)，维生素D对逆转多柔比星的耐药效应最为显著，逆转柔红霉素的耐药效应显著，但不及多柔比星。见表1。

表1 维生素D联合DNR、DOX、Arac、VCR48h后Jurcat及Jurcat/ADR的耐药逆转状况

2．2 Vit D对Jurcat/ADR内mdrl，mrpl mRNA表达的影响:无毒不同滴度Vit D作用JurcaL/ADR细胞株48h后，经Real-time PCR仪扩增，实验结果提示，实验组mdrl、mrpl mRNA表达显著低于对照组，且随Vit D质量浓度递增，mdrl、mrpl mRNA表达随之降低，呈现出剂量依赖性。见表2。

表2 Vit D对Jurcat/ADR内mdrl，mrpl mRNA表达的影响

注:A-r代表A-DNR，A-DOX，A-Arac，A-VCR的平均值，B-r、C-r、D-r以此类推。体现不同滴度Vit D对Jurcat/ADR内mdrl，mrpl mRNA表达的影响。我们可通过表2看到，Vit D浓度越高，抑制Jurcat/ADR内mdrl，mrpl mRNA表达作用越明显。

2.3 Vit D对Jurcat、Jurcat/ADR细胞内GSH水平的影响:Jurcat/ADR细胞株处于不同滴度Vit D中，随Vit D滴度递增能使Jurcat/ADR内GSH水平受到显著影响，抑制GSH药物外排泵可能促进了逆转Jurcat/ADR细胞的耐药性，见表3。

表3 Vit D对Jurcat、Jurcat/ADR细胞内GSH影响

3 讨 论

儿童白血病中90%以上为急性白血病，慢性白血病仅占3%～5%.主要是慢性粒细胞白血病[4]。儿童白血病在任何年龄均可发病，但以学龄前期和学龄期儿童多见；男性发病率高于女性。联合化疗缓解了儿童ALL，然而，介于MDR肿瘤细胞的影响，大部分传统化疗药物无法对MDR肿瘤细胞起到治疗作用，导致白血病复发，因此寻找安全有效的耐药逆转剂极具临床意义。

临床报告显示，长时间维生素 D的缺乏可导致个体患肺癌、胰腺癌和皮肤癌等多种癌症，或出现精神抑郁、心血管疾病、糖尿病等症状。研究结果显示ATRA与维生素D这2种药物在化疗过程中能有效增加MDR肿瘤细胞敏感性，同时减轻患者化疗后不良反应的发生几率。然而维生素D对于急性白血病耐药细胞株是否存在耐药逆转仍需实验验证。

本研究认为维生素D对多柔比星、阿糖胞苷、柔红霉素、长春新碱等不同化疗药物作用下的Jurcat/ADR存在耐药逆转效应，且对逆转多柔比星的耐药效应最强，对逆转环磷酰胺的效应较差。维生素D的水平越高逆转效应越强，体现了明显的药物浓度依赖性。耐药基因mRNA表达实验提示Jurcat/ADR细胞株中无明显变化，在Jurcat/ADR细胞株中mrpl mRNA的表达随着维生素D质量浓度的增加而减低。维生素D对Jurcat/ADR细胞表面P-gP水平的影响实验发现随着维生素D质量浓度的增加可降低。本实验发现随着维生素D质量浓度的增加可影响Jurcat/ADR细胞内的GSH水平，也存在药物浓度依赖性，推测逆转Jurcat/ADR细胞的耐药性可能是通过抑制GSH药物外排泵发挥作用。 综上所述，无毒剂量的维生素D与Jurcat/ADR细胞作用后可降低细胞mdrl及mrpl mRNA的表达，同时降低P-gp及GSH的表达量，可推测维生素D具备逆转MDR的作用，其机制可能是抑制细胞mdrl、mrpl耐药基因的表达和降低细胞表面P～gp及细胞内GSH含量有关，进而增加细胞内的药物浓度，提高化疗药物杀灭肿瘤细胞的作用。

[1] 张燕,张霞,魏超,等.急性白血病化疗患者抑郁状况调查分析[J].国际精神病学杂志,2015，18(3):77～79.

[2] 卢菲.急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究[D].山东大学,2014.

[3] 白晓玲,姚慧,赵洪宁,等.急性淋巴细胞性白血病患儿WT1基因与肿瘤耐药基因表达的关系[J].中华儿科杂志,2002,40(10):589～592.

[4] 邓开琴.维生素D缺乏与儿童疾病研究进展[J].医学综述,2015,21(23):4302～4304.

① 【基金项目】湖北省科技厅基金项目，(编号：BK2008254)

1006-6233(2016)12-2050-03

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.12.047