咪喹莫特油水分配系数及其与透皮吸收速率常数的相关性研究

时军，张慧迪，黄嗣航，吴艳婷，陈桂添

(广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006)



药剂学

咪喹莫特油水分配系数及其与透皮吸收速率常数的相关性研究

时军，张慧迪，黄嗣航，吴艳婷，陈桂添

(广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006)

目的 测定咪喹莫特的油水分配系数(P)，考察油水分配系数与透皮速率常数(J)之间的相关性。方法 采用HPLC法测定咪喹莫特的质量分数，摇床法和涡旋法测定油水分配系数，通过Franz扩散池法测定不同pH介质下药物的透皮速率常数，建立lgP与透皮速率常数间的相关模型。结果 摇床法和涡旋法所测得的lgP差异不明显，当溶剂介质pH值在4.5～7.4之间时，lgP随pH值增大而增大；lgP与透皮速率常数符合线性方程J=-1.47lgP2+4.15lgP-1.49,r=0.975 2。结论 介质pH值在pH5.8附近时，咪喹莫特的透皮吸收速率常数最大；当介质pH值在4.5～7.4之间时，咪喹莫特的透皮速率常数与lgP有良好线性关系。

咪喹莫特； 油水分配系数； 透皮吸收速率常数； 相关性

咪喹莫特(imiquimod)属咪唑喹啉胺类药物，是人工合成小分子化合物中唯一的干扰素诱导免疫反应调节剂[1]。咪喹莫特作用独特，不具有直接抗病毒活性，也不会引起直接的、非特异性细胞溶解破坏作用，而是通过降低Toll样受体TLR7和TLR8的竞争抑制作用，刺激多种免疫细胞产生一系列细胞素，诱导生成多种细胞因子，从而增强免疫调节作用[2]。作为第一个外用的免疫调节剂，咪喹莫特临床主要用于瘢痕疙瘩、尖锐湿疣的治疗，现有剂型为乳膏和霜剂。

药物的理化性质与透皮速率常数之间有密切关系，如溶解度、分子质量、晶型等都可影响药物的透皮吸收性能，通过测定药物的油水分配系数可获知药物对油/水的亲和能力，模拟药物在生物体内水相和生物相之间的分配情况，预测药物透皮性能是否良好[3]。本文测定了咪喹莫特的透皮吸收性能，并探讨咪喹莫特的油水分配系数与其透皮吸收速率间的关系，为咪喹莫特的纳米透皮制剂研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DIONEX UltiMate 3000 HPLC系统(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；1 000 μL移液枪(BIO-DL Genex Beta)；HH-2数显恒温水浴锅(常州智博瑞仪器制造有限公司)；XW-80A旋涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；SPH-200超凡型小容量全温度恒温培养振荡器(上海世平实验设备有限公司)；TP-6透皮扩散仪(天津市精拓仪器科技有限公司)；BP211D十万分之一电子天平(Sartorius AG)。

1.2 试剂

咪喹莫特原料药(武汉胜天宇生物科技有限公司,批号20151016)；咪喹莫特对照品(中国药品生物制品检定所，批号100632-200401)；色谱甲醇(Merck KGaA)；甲醇(批号20160210,天津市致远化学试剂有限公司)；正辛醇(批号20141111,天津市大茂化学试剂厂)；枸橼酸(批号20120827,国药集团化学试剂有限公司)；Na2HPO4(批号20150319,国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 动物

健康雌性SD大鼠6只，体质量(200±20)g，南方医科大学实验动物中心提供，证号：SCXK(粤)2011-0015。

2 方法与结果

2.1 咪喹莫特的测定方法[4]

2.1.1 检测波长的确定 精密称取一定量的咪喹莫特对照品，加入甲醇-质量分数0.06%磷酸水超声溶解，用紫外分光光度计在200～400 nm之间进行扫描，结果显示咪喹莫特在318 nm处有最大吸收峰，确定318 nm为检测波长。

2.1.2 样品溶液的制备 精密称取咪喹莫特对照品0.02 g，置于100 mL量瓶中，加入35%(体积分数，下同)甲醇溶液使溶解，定容至刻度，得对照品溶液。称取咪喹莫特原料药0.10 g，置于500 mL容量瓶中，加入35%甲醇溶液使溶解，定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：C18-PAQ(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相：甲醇-质量分数0.06%磷酸水溶液(体积比35∶65)，流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：318 nm，理论塔板数按咪喹莫特计不低于3 000。色谱图见图1。

302520151050-550403020100-5mAU1-咪喹莫特-6.1721-咪喹莫特-5.7730.02.04.06.08.010t/minBAmAU

图1 咪喹莫特对照品(A)与供试品溶液(B)的HPLC图
Figure 1 HPLC chromatograms of Imiquimod standard (A) and sample (B) solution

2.1.4 标准曲线的绘制 分别量取咪喹莫特对照品溶液(质量浓度为201.0 μg/mL) 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0 mL，置于5 mL容量瓶中，定容，摇匀，制备得到质量浓度为4.02、8.04、16.08、32.16、40.20、80.40、160.80 μg/mL的系列溶液，按“2.1.2”色谱条件进样10 μL，记录峰面积。以咪喹莫特对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性方程Y=0.449 3X+0.012 3,r=0.999 9，表明咪喹莫特在4.02～160.80 μg/mL范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.1.5 方法学考察 精密度试验RSD为1.32%，平均加样回收率为99.74%、RSD为2.19%，稳定性试验RSD为1.07%%，表明方法精密度、准确度良好，样品稳定。

2.2 表观油水分配系数的测定[5-6]

取正辛醇20 mL置于具塞锥形瓶中，分别用pH4.5、5.0、5.8、6.5、7.4的枸橼酸盐缓冲液饱和，(33±0.5)℃下振摇24 h，3 500 r/min离心20 min，分离正辛醇与缓冲液。精密称取咪喹莫特1.5 mg，用不同pH的缓冲液预饱和过的正辛醇溶解，置于25 mL的容量瓶中，定容。取被正辛醇饱和过的缓冲溶液和咪喹莫特正辛醇溶液，按1∶1(体积比)比例置于锥形瓶中，封口。将一部分锥形瓶内的溶液置于(33±0.5)℃恒温摇床内摇晃72 h，另一部分锥形瓶涡旋40 min，然后置于(33±0.5)℃恒温水浴中静置72 h，取出，以3 500 r/min离心20 min，取缓冲液层，定容。按“2.1.3”项下方法测定缓冲液相中咪喹莫特的浓度，按式(1)计算油水分配系数(P)：

(1)

式中：P为咪喹莫特的油水分配系数；C为缓冲溶液饱和正辛醇中初始药物的浓度，Cw为平衡后缓冲溶液中药物的浓度。

平行试验5次，取平均值，结果见表1。可见，摇床法和涡旋法所测得的lgP差异不明显，当溶剂介质pH在4.5～7.4之间时，lgP随pH值增大而增大。

表1 咪喹莫特在正辛醇-不同pH缓冲溶液的油水分配系数

pH值P摇床法涡旋法lgP摇床法涡旋法4.53.779±0.0873.314±0.1270.520±0.0110.577±0.0155.05.542±0.2255.910±0.3500.773±0.0170.744±0.0275.828.65±1.02128.65±0.6691.457±0.0161.528±0.0096.574.54±8.09773.43±9.1161.804±0.0541.872±0.0607.4151.9±6.818167.5±2.3212.224±0.0182.182±0.006

2.3 透皮吸收速率常数的测定

2.3.1 皮肤的预处理[7]取体质量180～220 g的雌性SD大鼠，麻醉处死，剥取腹部皮肤，刮净腹部鼠毛，剔除多余的脂肪和结缔组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干，将皮肤铺平，-20 ℃冰箱保存，1周内用完。

2.3.2 透皮吸收试验 将离体鼠皮恢复至室温，用生理盐水冲洗后，用滤纸吸干表面液体，置于Franz扩散池(有效释药面积为1.766 cm2，接收池体积为15 mL)的供给室与接收室之间，角质层朝向供给室。扩散池的接收室中加满pH值为6.5磷酸盐缓冲液为接受介质，排尽气泡，使接收介质与皮肤紧密接触。接收介质温度为(33±0.5)℃，磁力搅拌速度350 r/min。各组在供给室中分别加入2 mL咪喹莫特溶液(1 mg药物分别用pH4.5、5.0、5.8、6.5、7.4的缓冲液溶解)，于试验后1、2、4、6、8、12、24 h从接收室取样管精密吸取1 mL接受液(同时补充等量等温磷酸盐溶液)，接受液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，取10 μL滤液进样测定，将峰面积带入标准曲线计算药物浓度，按式(2)计算各时间点的单位面积累积透过量(Qn)：

(2)

式中：Qn为第n小时单位面积累积透过药量;Cn为第n小时取样的浓度;A为扩散池有效扩散面积。

平行试验6次，取平均值，拟合Qn-t方程，线性方程的斜率为透皮速率常数(J)，结果见表2。可见，咪喹莫特在pH5.8附近，透皮吸收速率常数最大。

表2 咪喹莫特在不同pH缓冲溶液的透皮吸收速率方程

Table 2 The penetration rate equation of Imiquimod in different pH buffer solution

pH值透皮吸收方程rJ/(μg·cm-2·h-1)4.5Q=0.3160t+2.54410.99680.3160±0.06455.0Q=0.7465t+2.31960.99730.7465±0.15005.8Q=1.5802t+4.90750.99651.5802±0.10626.5Q=1.0829t+3.30810.99701.0829±0.07497.4Q=0.5011t+2.73800.99520.5011±0.0844

2.4 咪喹莫特油水分配系数与透皮速率常数相关性研究

以透皮速率常数(J)对lgP作线性回归，发现一元二次方程拟合度最高，即J=-1.47lgP2+4.15lgP-1.49(r=0.975 2)，见图2。结果表明，在pH 4.5～7.4溶剂介质下，咪喹莫特的透皮性能和其油水分配系数密切相关，可以通过测定药物的油水分配系数预测药物的透皮性能。

图2 透皮速率常数和lgP拟合曲线示意图

Figure 2 The fitting curve of permeability rate constant and lgP

3 讨论

咪喹莫特是难溶性药物，其pKa为7.3，在弱酸性条件下微溶但会有微弱电离，随着溶解介质pH 值升高溶解度降低，因此有必要测定不同pH条件下的油水分配系数。本文研究表明，咪喹莫特在pH 5.8～7.4范围内，1

一般而言，脂溶性药物及油水分配系数大的药物较水溶性或亲水性药物容易透过角质层屏障，但是脂溶性太强，则难以透过水性的活性表皮和真皮层，易在角质层中蓄积[9]。本文结果显示，在pH值4.5～7.4范围内，咪喹莫特的透皮吸收速率常数与油水分配系数成二元方程关系，在pH 5.8附近，透皮吸收速率常数最大，透皮速率随分配系数增大到一定程度后，分配系数继续增大，透皮效率反而下降。因此，合理控制溶剂介质的pH值，可提高药物的透皮效应[10]。

药物脂溶性是影响生物膜吸收的重要因素。本文结果显示，咪喹莫特易溶于正辛醇层，而扩散介质pH值增大时，药物溶解度变小，提示咪喹莫特制成纳米脂质体制剂，要控制好外水相的pH值。

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(责任编辑：陈翔)

Study on the correlation between partition coefficient of imiquimod and transdermal absorption rate constant

SHI Jun,ZHANG Huidi,HUANG Sihang,WU Yanting,CHEN Guitian

(SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To determine the partition coefficient of imiquimod and study the correlation between oil-water partition coefficient (P) and penetration rate constant (J). Methods HPLC method was used to determine the concentration of Imiquimod,and the shaking method and vortex method was used to determine the oil-water partition coefficient. The penetration rate constant in different pH was determined by Franz diffusion cell method. The correlation model between lgPand percutaneous absorption rate was established. Results There was no significant difference between the shaking method and vortex method. When the solvent medium pH was between 4.5 and 7.4,lgPincreased with the promotion of pH value. lgPand the penetration rate constant were in line with the linear equationJ=-1.47lgP2+4.15lgP-1.49,r=0.975 2. Conclusion In the vicinity of pH5.8,the transdermal absorption rate constantJof Imiquimod reached the maximum. When the pH value of medium was between 4.5 and 7.4,there was a good linear relationship between the imiquimod penetration rate constantJand lgP.

imiquimod; oil-water partition coefficient; transdermal absorption rate constant; relationship

2016-08-03

广东省科技计划项目(2014A020212417,2013B021800088)

时军(1980—)，男，博士，副教授，主要从事中药新药及制剂新技术研究，电话:020-39352169，Email:shijun8008@163.com。

时间：2016-11-24 16:05

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161124.1605.003.html

R943

A

1006-8783(2016)06-0671-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016080303