六味地黄胶囊质量标准提升研究

张 竞，王艳伟

（河南省食品药品检验所，河南 郑州 450003）

六味地黄胶囊质量标准提升研究

张 竞，王艳伟

（河南省食品药品检验所，河南 郑州 450003）

目的 建立测定山茱萸中马钱苷含量的高效液相色谱（HPLC）法，修订并提高六味地黄胶囊的质量标准，增加熟地黄的薄层色谱鉴别方法。方法 色谱柱为 Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 m），流动相为乙腈－0．05%磷酸溶液（9∶91），流速为1．0 mL／min，检测波长为236 nm。结果 薄层色谱斑点清晰，阴性无干扰，马钱苷进样量在0．099～1．324 g范围内与峰面积线性关系良好（r＝0．999 9），平均回收率为99．13%，RSD为1．43%（n＝6）。结论 该法操作简便、专属性强，能更好地控制六味地黄胶囊的质量。

六味地黄胶囊；薄层色谱鉴别；马钱苷；高效液相色谱法

六味地黄胶囊收载于 2010年版《中国药典（一部）》，由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻组方，用于肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、骨蒸潮热、盗汗遗精、消渴，疗效确切，是滋阴补肾的代表方剂[1]。臣药酒萸肉中含有熊果酸、马钱苷、齐墩果酸等有效成分，现行质量标准采用薄层扫描法来测定酒萸肉中熊果酸的含量，专属性不强。现代研究证明，熊果酸并不是真正的活性成分，而马钱苷能显著增强机体免疫、抗炎、抗休克的作用，是酒萸肉的主要活性成分[2－3]。为更好地控制产品质量，本试验中参考文献[4－11]建立了测定六味地黄胶囊中马钱苷含量的高效液相色谱法，并增加了熟地黄的薄层色谱鉴别，为六味地黄胶囊的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Waters 2695型高效液相色谱仪－Waters 2998二极管阵列检测器；AX205DR型电子天平（瑞士Mettler公司）。六味地黄胶囊（不同生产企业提供，共14批次）；马钱苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号为111640－200503）；熟地黄对照药材（中国药品生物制品检定所，批号为121196－200502）；甲醇、乙腈为色谱纯（Merck公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 薄层色谱鉴别(熟地黄)

取本品内容物3 g，加水50 mL，温热使充分溶散，加热至沸，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取熟地黄对照药材4 g，加水60 mL，煎煮30 min，放冷，用脱脂棉滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。按处方和制备工艺制备缺熟地黄的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。取上述3种溶液各4 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以二甲苯－乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2，4－二硝基苯肼乙醇试液。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图1。耐用性试验考察了高湿度与低湿度（RH 75%，RH 25%）、室温与低温（RT 20℃，RT 18℃，RT 7℃）、不同厂家薄层色谱板（青岛海洋化工厂分厂、烟台市化学工业研究所）对薄层色谱峰的影响。结果表明，色谱分离基本无影响，方法可行。

图1 薄层色谱图

2．2 酒萸肉中马钱苷含量测定

2．2．1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），以乙腈－0．05%磷酸溶液（9∶91）为流动相；流速：1．0 mL／min；检测波长：236 nm；进样量：10 μL。理论板数按马钱苷峰计算应不低于4 000。

2．2．2 溶液制备

取马钱苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的本品内容物，研细，混匀，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按照处方比例制备缺山茱萸的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2．2．3 方法学考察

阴性对照试验：分别取2．2．2项下3种溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果在与对照品溶液色谱峰相应位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，马钱苷和相邻杂质峰分离良好，阴性对照品溶液无干扰，色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图

线性关系考察：精密称取马钱苷对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL含33．1 μg的对照品溶液，精密吸取3，5，10，15，20，30，40 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，以进样量（X）为横坐标、马钱苷峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝2 E＋06 X－86 077，r＝0．999 9(n＝6)。结果表明，马钱苷进样量在0．099～1．324 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2．2．2项下方法制备的对照品溶液，连续进样6次，测定。结果马钱苷峰面积的 RSD为0．61%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液（批号为100401），分别于0，2，4，6，8，10，12 h时各进样10 μL。结果马钱苷峰面积的 RSD为0．56%（n＝7），表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批样品（批号为100401）1 g，共6份，精密称定，按2．2．2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定马钱苷的含量。结果马钱苷含量平均值为 2．004 7 mg／g，RSD为 1．29%(n＝6)，表明该方法重复性良好。

加样回收试验：取已知马钱苷含量的样品（批号为100401）约0．5g共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入不同量的马钱苷对照品溶液（0．997 g／L）0．5，1．0，1．5 mL 3个浓度各2份，按拟订方法制备供试品溶液，测定马钱苷的含量，计算回收率。结果见表1。

表1 马钱苷加样回收试验结果（n＝6）

2．2．4 样品含量测定

取不同生产企业的样品共14批，按2．2．2项下方法制备供试品溶液，进样测定含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg／g）

3 讨论

检测波长选择：本试验中采用二极管阵列紫外检测器，于200～400 nm波长范围紫外光谱扫描显示，马钱苷在236 nm波长处有最大吸收，因此选择236 nm作为检测波长。

提取方式和溶剂选择：分别考察了50%甲醇加热回流和超声提取，结果表明，回流提取含量比超声提取较高，故选择回流提取。分别考察了甲醇和50%甲醇作为提取溶剂，结果表明，50%甲醇提取含量比甲醇提取较高，故选择50%甲醇提取。提取溶剂用量分别考察了50 mL和25 mL，50 mL比25 mL提取含量较高，故选择50%甲醇50 mL回流提取。

耐用性试验：考察了3根不同商品规格的色谱柱，如Agilent Zorbax SB－C18柱、Phenomenex Luna 5u C18柱和Wondasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），测定同一批样品，结果3种色谱柱测定结果重复性较好。

柱温试验：分别考察了柱温为25℃和40℃时进样测定马钱苷的含量，两者基本无差异。说明不同柱温测定结果的重复性较好。

本试验所测定的14批样品马钱苷含量存在较大差异，这与原料药材山茱萸中的马钱苷含量高低有关。因此，为了更好地控制六味地黄胶囊的质量，有必要加强原料药材山茱萸和制剂中马钱苷含量的检测。

综上所述，本试验中建立的方法操作简便、专属性强，精密度、重复性、回收率均满足要求，可作为六味地黄胶囊的质量控制方法。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：600－601．

[2]刘轶华，朱红丽．山茱萸的现代药理研究及应用[J]．中国医药指南，2012，10（31）：601－602．

[3]水彩红，曹 红．HPLC法测定山茱萸药材及六味地黄胶囊中马钱苷的含量[J]．中国药品标准，2005，6（4）：17－20．

[4]吴俊贤，陈楷斌，赵琦君，等．高效液相色谱法测定气阴养骨片中马钱苷含量[J]．中国药业，2011，20（9）：24－25．

[5]杨 锋，李 茜，费 嘉，等．对《中国药典》2010版一部六味地黄胶囊的商榷[J]．解放军药学学报，2012，28（6）：569－570．

[6]张翠英，李忠保，李振国，等．HPLC测定六味地黄颗粒中马钱苷和丹皮酚含量[J]．中成药，2008，30（12）：1 791－1 794．

[7]张晓坚，康 建．六味地黄丸（浓缩丸）质量标准研究[J]．中国药房，2009，20（27）：2 133－2 135．

[8]阎东海．HPLC测定浓缩六味地黄丸中马钱苷含量[J]．中国现代中药，2007，9（7）：18－19，23．

[9]林 静，乐卿清，谢荣伟．高效液相色谱法测定六味地黄丸（浓缩丸）中马钱苷的含量[J]．海峡药学，2010，22（6）：91－92．

[10]姜建萍，曹 音，李建芳．六味地黄丸含量测定方法研究进展[J]．中医药导报，2010，16（6）：136－138．

[11]王 聪．RP－HPLC测定六味地黄丸中马钱苷的含量[J]．中国中医药现代远程教育，2015，13（2）：146－147．

Research on Improving the Quality of Liuweidihuang Capsules

Zhang Jing，Wang Yanwei
（Henan Provincial Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou，Henan，China 450003）

Objective To establish an HPLC method for the content determination of loganin in Fructus Corni，and to modify and improve the quality standard for Liuweidihuang Capsules，to add the TLC method ofRadix Renntanniae．Methods Agilent Zorbax SB－C18column（250 mm×4．6 mm，5 μm） was used with the mobile phase consisted of acetonitrile－0．05% phosphoric acid（9∶91），at the flow rate of 1．0 mL／min，the detection wavelength was 236 nm．Results The TLC spots were clear and there were no interferences on the negative controls．The liner range of loganin was 0．099－1．324 μg（r＝0．999 9）．The average recovery was 99．13%，RSD was 1．43%（n＝6）．Conclusion This method is simple，specialty and suitable to control the quality of Liuweidihuang Capsules．

Liuweidihuang Capsules；TLC；loganin；HPLC

张竞，大学本科，研究方向为药物分析，（电子信箱）zjing780624＠163．com。

2015－06－17；

2015－08－05)

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)02－0061－03