异甘草素对人鼻咽癌CNE2细胞裸鼠移植瘤模型的放疗增敏作用

郭俊宇 陈应超

异甘草素对人鼻咽癌CNE2细胞裸鼠移植瘤模型的放疗增敏作用

郭俊宇 陈应超

目的 观察异甘草素对鼻咽癌裸鼠移植瘤放疗的增敏效应，并探讨其与乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)表达水平之间的关系。方法取低分化鼻咽癌CNE2细胞接种于雌性裸鼠皮下(共接种20只)，待肿瘤结节4～6 mm时，将裸鼠随机分为4组，分别为对照组、异甘草素组(50 mg·kg-1·周-1)、放疗组、异甘草素(50 mg·kg-1·周-1)联合放疗组。依照各组不同治疗措施处理，定期测量瘤体体积，20 d后处死裸鼠，剥离瘤体称重。分别计算4组抑瘤率。采用荧光定量PCR检测瘤体组织中HIF-1α及VEGF mRNA的表达水平。结果异甘草素联合放疗组移植瘤的体积和重量显著下降，与对照组、单纯异甘草素及单纯放疗组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；异甘草素联合放疗组HIF-1α、VEGF mRNA表达水平明显下降, 与对照组及放疗组相比，差异有统计学意义(P<0．05)。结论异甘草素能增强鼻咽癌裸鼠移植瘤对放疗的敏感性，其作用机制可能与抑制HIF-1α、VEGF表达水平，从而抑制肿瘤血管生成作用有关。

异甘草素；鼻咽肿瘤；放疗增敏；HIF-1α；VEGF

鼻咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤，其发病率在头颈部肿瘤中一直居高不下。对于鼻咽癌患者的治疗，强调以适形放疗为主，放化疗联合的综合治疗。早期鼻咽癌患者(Ⅰ、Ⅱ期)的预后尚可，5年总生存率接近80%，但由于复发和远处转移的存在，晚期(Ⅲ、Ⅳ期)鼻咽癌治疗仍然不容乐观，该类患者往往对放疗不敏感，5年生存率仅达30%～40%[1,2]。影响鼻咽癌治疗的主要因素为肿瘤的复发和远处转移，而肿瘤新生血管生成在肿瘤复发和转移过程中发挥着重要作用，因此，寻找针对肿瘤血管生成的新的靶向药物，提高鼻咽癌的放疗敏感性，对改善鼻咽癌的治疗现状具有重要意义。近年来，我国学者从中草药中分离出多种具有抗肿瘤活性的天然化合物，这些化合物多具有多靶点、多效应以及低毒性的特点，在抗肿瘤研究中做出了很大的贡献。甘草素及其衍生物，从甘草属植物的根茎中提取，多属于黄酮类化合物，国内外多项研究均报道其在体内及体外均具有显著的抗肿瘤活性和抗炎活性[3]。异甘草素从甘草根的水解产物中分解得到，结构为经基查耳酮类化合物，在肝癌、胃癌及食管癌等多种肿瘤中均可发挥抗癌作用，研究发现其作用机制包括抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，诱导自噬以及抗血管生成等多方面的作用[4-6]。而目前国内外尚无关于异甘草素在头颈部肿瘤中的研究，同时也少有研究报道异甘草素对肿瘤放疗敏感性的影响。因此，我们的研究研究旨在探讨异甘草素是否对人鼻咽癌CNE2细胞裸鼠移植瘤模型存在放疗增敏作用并探讨其机制，以期为异甘草素在肿瘤治疗中的研究和应用提供实验室数据。

1 材料与方法

1.1 细胞及动物培养 人低分化鼻咽癌CNE2细胞株来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。CNE2细胞培养于RPMI 1640+10%胎牛血清+1%青链霉素的培养基中，置于37℃、5% CO2饱和湿度的孵育箱中进行培养。当细胞处于对数生长期且90%融合时，用胰酶消化用于裸鼠移植瘤的建立。BALB/c裸鼠(雌性，6周龄，体重16～20 g，型号：429991216)，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于恒温(20～25℃)、恒湿的SPF层流环境中，采用经高压灭菌的标准饲料和无菌饮用水。

1.2 主要试剂 RPIM 1640培养基，0.25%EDTA胰酶购自杭州吉诺试剂公司，胎牛血清购自美国GIBCO公司，青链霉素购自杭州碧云天有限公司；逆转录试剂盒及Real-time PCR kit购自TAKARA公司；引物由上海生工公司合成，各引物序列如下：HIF-1α引物序列：上游5’-GTGGTGGTTA CTCAGCACTTT-3’和下游5’-ATCTCCGTCCCTCAACCTCT-3’；VEGF引物序列：上游5’-GAATGGGGAGCCCAGAGTG-3’和下游5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGA-3’；GADPH引物序列：上游5’-AAAGCCTGCCGGTGACTAA-3’和下游5’-AGGAAAAGCATCAC CCGGAG-3’。异甘草素购自上海同田公司，纯度为99%，用PBS溶解，保存浓度为0.1 g/ml，于-20℃保存备用。

1.3 裸鼠移植瘤模型建立 CNE2细胞培养于 75 cm2培养瓶中(细胞量约为2×107/瓶)，当细胞处于对数生长期时，加入3 ml 0.25%EDTA胰酶消化，消化3 min后，加入5～10 ml培养基中和，并吹打制备单细胞悬液，使用细胞计数板进行计数，离心并加入PBS重悬，使细胞终浓度为1.0×107个/ml。注射器吸取上述细胞悬液200 μl(细胞量为2×106个)，接种于裸鼠背部皮下，共接种裸鼠20只。整个操作过程均在SPF环境内进行。接种后定期观察裸鼠注射点附近皮肤有无肿瘤形成，成瘤标准为肿瘤直径为5 mm×5 mm(长径×短径)。

1.4 分组及处理 皮下注射1周后，裸鼠成瘤率为100%(标准为瘤体长短径大于5 mm×5 mm)。按照随机分组表进行分组，分为4组，每组5只裸鼠，处理措施：(1)对照组：不作其他处理，给予与药物组等体积的0.9%氯化钠溶液腹腔注射；(2)异甘草素组：给予异甘草素腹腔注射，注射量按裸鼠体重计算，每周给药50 mg/kg；(3)放疗组：给予电子直线加速器照射，5 d/次，每只每次局部照射量为5 Gy；(4)放疗+异甘草素组：同时给予(2)组和(3)组处理。给药第1天开始测量肿瘤的长径和短径，每3天测量1次。肿瘤体积计算公式为V=1/2(a×b)2，根据体积计算各组的抑瘤率：抑瘤率(%)=(1-实验组瘤体重的均数/对照组瘤体重的均数)×100%。给药20 d后处死裸鼠，剥离瘤体，称重记录瘤体重量。留取部分移植瘤组织用，保存于液氮中，用于后续检测。

1.5 荧光定量PCR检测不同组别瘤体中HIF-1α、VEGF mRNA的表达 提取裸鼠移植瘤标本组织中的总RNA，紫外分光光度计测RNA纯度及浓度。RT-PCR采用TAKARA 逆转录试剂盒20 μl体系，其中RNA模板为1 μg，Oligo dT引物和随机引物各1 μl， PCR buffer为 4 μl(包含镁离子、dNTPs、甘油等)，逆转录酶为1 μl，其余用DEPC水补足，RT-PCR反应条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃∞；Real time PCR：本实验采用20 μl反应体系，其中模板为100 ng，HIF-1α、VEGF上下游引物各使用1 μl，TAKARA SYBR GREEN为10 μl，其余用DEPC水补足；Real time PCR反应条件为：95℃预变性3 min， 95℃ 30 s+57℃30 s+72℃ 30 s共计40个循环，72℃ 3 min，4℃∞，并在退火时采集荧光值。

2 结果

2.1 4组移植瘤的体积比较 治理前4组移植瘤体积差异均无统计学意义(P>0.05)；处理20 d后，异甘草素组、放疗组和放疗+异甘草素组与对照组相比，瘤体体积差异变化差异均有统计学意义(P<0.05)，其中放疗+异甘草素组处理组瘤体体积最小，与单独放疗组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，根据各组瘤体体积绘制移植瘤生长曲线，可见放疗+异甘草素组移植瘤增长速率最低，说明异甘草素治疗联合放疗，可有效增加裸鼠鼻咽癌移植瘤模型对放疗的敏感性。见表1，图1。

表1 4组移植瘤的体积比较

组别对照组异甘草素组放疗组放疗+异甘草素组治疗前68.5±4.771.8±6.265.3±3.871.4±7.7治疗后662.3±66.1*532.7±50.2*325.3±51.3*219.7±52.3*体积变化593.8±23.8460.9±17.6#260.0±20.7#148.3±18.9#

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

图1 4组移植瘤生长曲线

2.2 4组瘤体的重量比较 剥离瘤体后，称重4组移植瘤重量，发现与对照组相比，异甘草素组，放疗组和放疗+异甘草素组的瘤体重量均显著下降，其中放疗+异甘草素组移植瘤重量最小，与对照组相比和放疗组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。根据公式计算各实验组抑瘤率，可知异甘草素组，放疗组和放疗+异甘草素组的抑瘤率分别为14.7%，50.8%，68.4%，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图2。

组别对照组异甘草素组放疗组放疗+异甘草素组移植瘤质量(g)1.42±0.651.17±0.430.69±0.530.56±0.74抑瘤率(%)14.750.860.4P值0.3820.0430.017

图2 治疗后4组移植瘤的质量

2.3 荧光定量 PCR检测乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA在各组瘤体中的表达差异 TRIZOL法提取鼻咽癌瘤体组织标本的RNA，经RT PCR之后，Real time PCR检测HIF-1α、VEGF mRNA在4组裸鼠中的表达情况。与对照组和放疗组相比，放疗+异甘草素组HIF-1α mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05)；同时，放疗+异甘草素组VEGF mRNA水平表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，说明异甘草素治疗联合放疗对鼻咽癌裸鼠移植瘤模型的放疗增敏作用，可能是通过对HIF-1α、VEGF的调控来实现的。见表3，图3。

组别对照组异甘草素组放疗组放疗+异甘草素组P值HIF-1α0.39±0.090.30±0.050.35±0.070.19±0.030.023VEGF 0.57±0.080.49±0.090.52±0.110.21±0.020.015

图3 荧光定量PCR检测4组移植瘤HIF-1α、VEGF mRNA表达差异

3 讨论

鼻咽癌好发于东南亚及我国南方的广东、广西等地区，据统计，在这些高发地区，鼻咽癌每年的发病率为(15～50)人/10万，且在近年来呈现逐年上升趋势[7]。早期非转移性鼻咽癌患者因其对放射线的高敏感性，采用局部强化放射治疗一般可获得满意疗效[8]。但对于中晚期鼻咽癌患者而言，由于区域复发及远处转移的发生，往往对放化疗不敏感，预后较差。因此，针对该类鼻咽癌患者，寻找新的方法以提高鼻咽癌对放射治疗的敏感性，一直是国内外学者们研究的热点内容，也是改善鼻咽癌患者生存质量以及远期疗效的重要途径。近年来，中药复方及单体有效成分的抗肿瘤作用越来越受到国内外学者们的重视。异甘草素作为黄酮类化合物中典型的一种，从甘草属植物中提取获得，有多项研究表明其在体内及体外可发挥显著的抗肿瘤作用[9-11]。目前国内外对异甘草素抗肿瘤的研究多集中在体外实验，由于体外研究难以真实地模拟药物在体内的代谢过程，具有一定的局限性，因此，本研究通过构建鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，探究异甘草素在鼻咽癌中是否具有放疗增敏作用，并进行相关的机制研究。

本研究结果发现，给予鼻咽癌裸鼠移植瘤模型定期腹腔注射一定浓度的异甘草素，能有效增加鼻咽癌裸鼠移植瘤模型对放疗的敏感性。与对照组相比，我们发现同时给予腹腔注射异甘草素和定期局部放疗照射处理后，鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长收到了显著的抑制，与单独应用局部放疗以及单独腹腔注射异甘草素相比，移植瘤体积及重量差异均具有显著的统计学意义(P<0.05)。同时，异甘草素组、放疗组、放疗+异甘草素组的抑瘤率分别为14.7%，50.8%，68.4%，说明异甘草素能有效增加鼻咽癌裸鼠移植瘤的放疗敏感性。Baba等[12]报道在化学致癌剂氧化偶氮甲烷诱导的小鼠结肠腺癌模型中，异甘草素具有潜在的预防和治疗结肠癌的作用。Chin等[13]研究证明腹腔注射浓度为300 mg/kg的异甘草素, 可显著降低二甲肼(1,2-dimethylhydrazine)诱导的小鼠结肠癌和肺癌的发病率。本研究发现在鼻咽癌裸鼠异位移植瘤模型中，异甘草素不仅能有效抑制裸鼠移植瘤的生长，同时也可有效增加其放疗敏感性，其作用机制还有待进一步的研究。

血管生成在鼻咽癌的发生、发展和转移过程中发挥着重要作用[14]。既往研究表明，放疗时造成的乏氧环境，诱导细胞内产生大量的乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)，从而刺激其下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等的过度表达，促进肿瘤血管生成。同时，肿瘤血管形成又可降低放射敏感性, 引起放射抗拒[15-17]。因此，抑制肿瘤血管新生，可有效增加多种肿瘤的放疗敏感性。本研究结果发现，异甘草素联合放疗组HIF-1α、VEGF mRNA表达水平显著下降，与对照组、放疗组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示异甘草素联合放疗对鼻咽癌裸鼠移植瘤的放疗增敏作用，可能与降低了血管生成相关因子HIF-1α、VEGF的表达水平有关，从而为鼻咽癌的放射增敏治疗提供了实验依据。

综上所述，本研究发现异甘草素对人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型存在显著的放疗增敏作用，机制研究发现其作用可能通过抑制血管生成相关因子HIF-1α、VEGF的表达，从而抑制肿瘤新生血管生成来实现。放疗耐受是影响鼻咽癌患者治疗和预后的主要因素之一。异甘草素在体内动物模型中，可有效的增加鼻咽癌的放疗敏感性，具有相当可观的抗肿瘤潜能。随着临床研究的深入，本研究将为鼻咽癌的放疗增敏剂在临床中的运用提供实验依据，从而为进一步提高鼻咽癌患者的放、化疗效果提供解决方案。

1 程金建,杨华,陈甲信,等.调强放疗及化疗对鼻咽癌患者营养状况的影响.广东医学,2011,32:2336-2338.

2 Sze H,Blanchard P, Ng WT, et al.Chemotherapy for nasopharyngeal carcinoma-current recommendation and controversies.Hematol Oncol Clin North Am,2015,29: 1107-1122.

3 Lahiry L, Saha B, Chakraborty J, et al. Contribution of p53-mediated Bax transactivation in the aflavin- induced mammary epithelial carcinoma cell apoptosis. Apoptosis,2008,13: 771-781.

4 Chin YW,Jung HA,Liu Y,et al.Anti-oxidant constituentsofthe roots and stolons of licorice(Glycyrrhizaglabra).JagricFood Chem,2007,55: 4691.

5 Sun ZJ, Chen G, Zhang W, et al.Mammalian target of rapamycin pathway promotes tumor- induced angiogenesis in adenoid cystic carcinoma:its suppression by isoliquiritigenin through dual activation of c-Jun NH2-terminal kinase and inhibition of extracellular signalregulated kinase. J Pharmacol Exp Ther,2010,334: 500-512.

6 Tsuji S,Yasuda K,Sumi G,et al. Shakuyaku-kanzo-to inhibits smooth muscle contractions of human pregnant uterine tissue in vitro. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research,2012,38:1004-1010.

7 Kam MK, Leung SF, Zee B,et al.Prospective randomized study of intensitymodulated radiotherapy on salivary gland function in early-stage nasopharyngeal carcinoma patients.J Clin Oncol,2007,25:4873-4879.

8 Chua DT, Sham JS, Kwong DL,et al.Treatment outcome after radiotherapy alone for patients with Stage Ⅰ～Ⅱ nasopharyngeal carcinoma. Cancer,2003,98:74-80.

9 Hsu YL, Kuo PL, Lin CC.Isoliquiritigenin induces apoptosis and cell cycle arrest through p53-dependent pathway in Hep G2 cells. Life Sci,2005,77: 279-292.

10 Ma J,Fu NY, Pang DB, et al. Apoptosis induced by isoliquiritigenin in human gastric cancer MGC-803 cells. Planta Med,2001,67: 754-757.

11 Takahashi T, Baba M, Nishino H,et al. Cyclooxygenase-2 plays a suppressive role for induction of apoptosis in isoliquiritigenin-treated mouse colon cancer cells.Cancer Lett,2006,231:319-325.

12 Baba M,Asano R,Takigami I,et al.Studies on cancer chemoprevention by traditional folk medicines XXV. Inhibitory effect of isoliquiritigenin on azoxymethane-Induced murine colon aberrant crypt focus formation and carcinogenesis.Biol Pharm Bull,2002,25:247.

13 Chin YW, Jung HA, Liu Y, et al. Anti-oxidant constituents of the roots and stolons of licorice(Glycyrrhiza glabra).J Agric Food Chem,2007,55: 4691.

14 尹中普, 孙晓. HIF-1α和GLUT-1在鼻咽癌组织中的表达及其临床意义. 中国肿瘤生物治疗杂志,2015,22: 495-499.

15 Wang Y, Lei F, Rong W, et al.Positive feedback between oncogenic KRAS and HIF-1α confers drug resistance in colorectal cancer.Onco Targets Ther,2015,8:1229-1237．

16 Willett CG, Duda DG, di Tomaso E, et al. Efficacy,safety, and biomarkers of neoadjuvant bevacizumab，radiation therapy, and fluorouracil in rectal cancer:a multidisciplinary phase II study.Journal of Clinical Oncology,2009,27: 3020-3026.

17 Swartz JE, Pothen AJ, Stegeman I,et al.Clinical implications of hypoxia biomarker expression in head and neck squamous cell carcinoma: A systematic review. Cancer Med,2015,4: 1101-1116.

Effects of isoliquiritin on the radiotherapy sensitization in nude mice models of transplantation tumor with nasopharyngeal carcinoma of CNE2 cells

GUOJunyu,CHENYingchao.

DepartmentofOtolaryngology,CentralHospitalofXiaoganCity,Hubei,Xiaogan432100,China

Objective To observe the radiotherapy sensitization of isoliquiritin in nude mice models of transplantation tumor with nasopharyngeal carcinoma of CNE2 cells,and to explore the correlation between isoliquiritin and the expression levels of HIF-1α and VEGF.Methods The nasopharygeal cell line-CNE2 cells were inoculated into 20 female nude mice, when tumor nodule reached 4～6mm,these mice were randomly divided into four groups:control group, isoliquiritin group (50mg·kg-1·w-1),radiotherapy group (20Gy), isoliquiritin (50mg·kg-1·w-1) combined radiotherapy (20Gy) group (combination treatment group). The tumor size was measured regularly. After 20 days,the mice were sacrificed,the volume and weight of tumors were detected,moreover,the tumor inhibition rates were calculated and the expression levels of HIF-1αand VEGF mRNA were detected by Real-time PCR in the four groups.Results The volume and weight of tumors in combination treatment group were significantly decreased,as compared with those in the other three groups (P<0.05).Moreover the expression levels of IF-1α and VEGF mRNA in combination treatment group were significantly decreased,as compared with those in control group and radiotherapy group (P<0.05).Conclusion Isoliquiritin can enhance radiotherapy sensitization in nude mice of transplantation tumor with nasopharyngeal carcinoma,and its action mechanism may be correlated to its inhibitory effects on expressions of HIF-1α and VEGF so us to inhibit tumor angiogenesis.

isoliquiritin; nasopharyngeal neoplasms; radiotherapy sensitization; HIF-1α; VEGF

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.24.005

432100 湖北省孝感市中心医院耳鼻咽喉科

陈应超，432100 湖北省孝感市中心医院耳鼻咽喉科；

E-mail：81176180@qq.com

R 739.6

A

1002-7386(2016)24-3704-04

2016-09-11)