抗菌肽对糜烂型OLP患者唾液中真菌的影响

郭 岩， 张 英

(中国医科大学附属口腔医院 急诊粘膜科，辽宁 沈阳 110001 )

抗菌肽对糜烂型OLP患者唾液中真菌的影响

郭 岩， 张 英*

(中国医科大学附属口腔医院 急诊粘膜科，辽宁 沈阳 110001 )

抗菌肽经临床研究，发现具有抗生素不具备的优点，可对糜烂型口腔扁平苔藓(oral lichen planus，OLP)患者唾液中真菌有抑制和杀菌的作用，弥补了抗生素的缺点。通过使用不同浓度、不同种类的抗菌肽,作用于自糜烂型OLP患者口腔唾液标本中提取并经鉴定的菌种，对三种常见菌——白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌进行抑菌试验。结果表明，抗菌肽使用前后的数值比对、菌落生长情况、最小抑菌值有明显变化。发现RISE-AP12对三种常见真菌的抑菌、杀菌效果优于其他的抗菌肽，在临床上有较大应用前景。

口腔糜烂型扁平苔藓；念珠菌；抗菌肽

口腔扁平苔藓(oral lichen planus，OLP)是慢性浅表性炎症的黏膜角化异常性疾病，是口腔黏膜病中最常见的疾病之一。其特点是周期性复发，有自限性，并伴有剧烈疼痛，任何年龄人群均可患病。患者会出现黏膜充血、糜烂、溃疡、萎缩、水泡等，局部伴有敏感、灼痛，癌前病变。该病病因目前尚不明确，除心理和免疫因素外，感染因素越来越受重视，主要针对细菌、病毒、真菌关注的较多[1-2]。张英等[3]、徐岩英等[4]通过多因素分析的结果表明，念珠菌感染是诱导OLP的危险因素之一。口腔扁平苔藓传统的临床治疗多采用抗菌类、止痛类、免疫调节类等药物进行治疗，各种药物配伍复杂，长期使用副作用大，且收效甚微[5]。抗菌肽应用于口腔领域越来越受到重视。抗菌肽是生物体内广泛存在的一类多肽，是用来抵抗外来微生物的入侵和体内一些突变细胞而产生的代谢产物[6-7]，存在于上皮和免疫组织中，具有抗菌、抑菌、抗病毒、抗肿瘤的功能。人类抗菌肽构成了机体先天性免疫系统的第一道防线。 RISE-AP12是美国锐瑟公司人工合成的新型抗菌肽，Daptomycin由美国Cubist pharmaceuticals公司生产，主要治疗革兰阳性菌引起的疾病。P113/P113D由美国Demegen/pacgen公司研制，主要治疗口腔真菌感染[8-9]。但是关于抗菌肽治疗口腔糜烂型扁平苔藓的研究目前少见报道。本研究通过提取糜烂型OLP患者唾液中常见菌种，经体外鉴定，用不同种类、不同浓度的抗菌肽对其作用，观察其抑菌和杀菌结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 患者来源 选取2015年9月至2016年6月于中国医科大学口腔医院黏膜病科就诊患者40例，所有OLP患者由2名医生临床诊断，并由组织病理学确诊。纳入标准：①病例均符合OLP诊断标准；②糜烂面发生时间7 d，患者需具备清晰判断及表达疼痛程度能力，自愿参加临床实验，并签署知情同意书。排除标准：①患口腔白斑、多形性红斑者；②患全身系统性疾病、贫血、消化性溃疡、急性感染性疾病、自身免疫性疾病者；③24 h内使用镇痛药、1个月内使用抗生素消炎药、3个月内吸烟、嗜酒者；④肿瘤患者；⑤不能按时复诊者；⑥妊娠期者。

1.1.2 主要试剂与材料 改良沙氏琼脂培养基(青岛海博公司)；氯霉素(青岛海博公司)；念珠菌显色培养基(法国科玛嘉 CHROMagar)；琼脂糖 (美国Promaga公司)；胎牛血清 (赛默飞世尔生物化学制品有限公司)；HBIS培养基(取48 g BHI培养基加入1 000 mL双蒸水，磁力搅拌器常温搅拌10 min，高压10 min后置于45 ℃恒温水浴，待温度均衡后，加入过滤除菌的氯霉素，使其终浓度为5 μg/mL)。抗菌肽RISE-AP12(美国锐瑟公司)，Daptomycin(美国Cubist pharmaceuticals公司)，P113/P113D(美国Demegen/Pacgen公司)。

1.1.3 主要仪器设备 Nikon正置荧光显微镜(日本，80i型)；ATB鉴定试条ID32C(法国梅里埃公司)；制冰机(德国Zigera，2BE-70-25型)；超纯水机(台湾艾柯，KL-RO-20型)；高速低温台式离心机(美国Sigma，90-2型)；紫外分光光度计(英国UV-visible Spectrometer，UV300型)；恒温孵箱(上海博泰，XMTD-8000型)；超低温冰箱(青岛Haier，DW-40L262型)。

1.2 方法

1.2.1 唾液留存及真菌提取 ①样本采集：上午10点左右，采集受试者唾液0.5～1 mL送检； ②样本稀释：将样本稀释成10-1～10-6浓度备用；③样本的接种和培养：取稀释浓度为10-2～10-6的样本液各0.1 mL，分别接种于普通血琼脂和HBIS血琼脂培养基，用玻棒将样本液均匀涂布后置需氧或厌氧环境(800 mL/L N2、100 mL/L CO2、100 mL/L H2)，培养24 h或48 h。

1.2.2 唾液菌群菌种鉴定 ①用ATB(automatic testing bacteriology)细菌自动鉴定及药敏分析仪鉴定(简称ATB法)；②真菌学检查的种类：唾液中检查白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌等；③可疑病原细菌有葡萄球菌、消化链球菌、不产黑色素普氏菌(包括口腔普氏菌、口普氏菌等)，产黑色素厌氧杆菌(包括牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌等)、羧杆菌(包括具核羧杆菌、牙周羧杆菌等)[10]。

1.2.3 受试液的配制及最低抑菌浓度(MIC)的测定 将质量浓度为2 mg/mL的3种抗菌肽RISE-AP12、Daptomycin、P113/P113D稀释至1 mg/mL，直至最低质量浓度为0.5 mg/mL。采用平板涂布法，取制备好的菌悬液100 μL，分别加入培养基中，用无菌涂布棒涂抹均匀；分别取不同浓度的受试液300 μL置于菌悬液的培养基中，用无菌涂布棒涂抹均匀，重复试验3次，37 ℃厌氧培养48 h，观查培养皿中真菌生长情况，记录菌落。完全没有真菌生长的浓度为最低抑菌浓度MIC(mg/mL)。

1.2.4 菌落形成单位计数(colony forming units，cfu)计数 ①制备培养基：配制沙氏琼脂培养基,121 ℃、灭菌20 min，置于45 ℃恒温水浴锅中，加入过滤除菌的氯霉素使终浓度为5 μg/mL后备用。②编号：取3支盛有4.5 mL无菌水的试管，编号为10-1、10-2、10-3。③稀释菌液：稀释样品前先将待测样品充分摇匀，精确吸取0.5 mL菌液至10-1试管中，如此稀释至10-3。④取样：精确吸取10-1、10-2、10-3稀释液各100 μL，加至相应编号的无菌培养皿中，重复3次。⑤倒培养基：菌液移入培养皿后立即倒入融化并冷却至45 ℃左右的沙氏琼脂培养基(倒入量约10～12 mL)，轻轻晃动培养皿使菌液和培养基充分混匀后平置，待凝。摇匀平板菌液。3种浓度的菌液分别放入血琼脂和HBIS血琼脂培养。⑥倒置培养：待平板完全凝固后，倒置于37 ℃恒温箱中培养。⑦菌落计数：培养48 h后取出平板，统计平皿中的菌落数并记录结果。

2 结果与分析

2.1 糜烂型OLP患者唾液中真菌检出情况

糜烂型OLP患者40例，检出白色念珠菌25例，占总人数的62.5%；光滑念珠菌检出9例，占22.5%；热带念珠菌检出6例，占15%(见表1)。

表1 糜烂型OLP患者唾液中不同类型真菌检出情况Table 1 Erosion type different types of fungus detection in patients with OLP

2.2 抗菌肽的抑菌和杀菌效果

使用质量浓度2 mg/mL RISE AP-12、Daptomycin、P113/P113D抗菌肽前后,真菌菌落数的对比(X±S)情况见表2。

表2 3种相同质量浓度的抗菌肽使用前后真菌菌落数的对比(X±S)Table 2 Use antibacterial peptide concentration 2 mg/mL RISE-AP12，Daptomycin， P113/P113D fungal colony countbefore and after contrast(X±S)

结果显示，2 mg/mL的RISE-AP12对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌3种真菌的抑菌作用强于2 mg/mL的Daptomycin 和P113/P113D。在白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌3种真菌平板上，使用不同浓度RISE-AP12、Daptomycin、P113/P113D抗菌肽，真菌的菌落生长情况见表3。

表3 真菌菌落总数Table 3 The selected bacteria colony total record results

由表3可知，RISE-AP12对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌最低抑菌浓度为1 mg/mL；Daptomycin对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌最低抑菌浓度为2 mg/mL，P113/P113D则更高。0.9%生理盐水有大量菌落生长，对实验结果无法参照，由此看出RISE-AP12的MIC值低于Daptomycin和P113/P1I13D。

抗菌肽具有广谱的杀菌特性，对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有抑制作用[8-9]。 2 mg/mL抗菌肽RISE-AP12对于阳性对照、阴性对照及细菌培养前对照A600nm分别为0.310 3±0.004 2、0.065 53±0.000 8及0.061 7±0.000 22。加入最终质量浓度为1.0 mg/mL、0.5 mg/mL抗菌肽RISE-AP12的A600 nm(0.048 2±0.001 5、0.051 1±0.001 8)分别与阴性对照组及真菌培养前对照比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，其余两种抗菌肽有统计学意义。

3 讨 论

本研究通过使用不同浓度、不同种类的抗菌肽，作用于自糜烂型OLP患者口腔唾液标本中提取的经鉴定的菌种，对3种常见菌——白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌进行抑菌试验，发现抗菌肽2 mg/mL RISE-AP12使用前后白色念珠菌的数值由8 496.95±107.291变为2 008.95±89.112；光滑念珠菌由8 486.60±106.243变为2 318.70±99.981;热带念珠菌由8 521.30±116.011变为2 339.35±103.269，其余两种2 mg/mL Daptomycin和P113/P113D抗菌肽对以上3种真菌影响小于2 mg/mL RISE-AP12。从菌落生长情况看，RISE-AP12对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌最低抑菌浓度为1 mg/mL，而其余2种抗菌肽对这三种真菌的最低抑菌浓度则高于RISE-AP12。RISE-AP12对3种真菌的抑菌杀菌效果优于其他2种抗菌肽，在临床上有较大的应用前景。

目前，抗菌肽在口腔中的应用研究处于全面起步探索阶段，抗菌肽对OLP病菌的高效杀菌、抑菌作用为口腔真菌的药物治疗提供了新的理论依据[11]。因此，抗菌肽在治疗糜烂型扁平苔藓感染性疾病中表现出极大的应用前景[12-13]。另外，抗菌肽是生物体先天性免疫防御系统的重要组成部分，可以调节机体免疫功能，同时也可能是皮肤及糜烂黏膜再生的潜在性物质，在治疗糜烂型扁平苔藓方面具有潜在的应用价值[14]。

[1] 陈谦明,周曾同.口腔黏膜病学(第4版)[M].北京：人民卫生出版，2010:101-107.

[2] Schaller M, Schackert C, Korting HC, et al.Invasion ofCandidaalbicanscorrelates with expression of secreted aspartic proteinases during experimental infection of human epidermis[J].J. Invest. Dermatol,2000,114 :712-717.

[3] 张英，闻妍，康媛媛. 成人口腔黏膜念珠菌病的多因素分析[J].微生物学杂志,2009,29(6):45-48.

[4] 徐岩英,胡碧琼.成人口腔念珠菌感染易感因素的多元分析[J].中华口腔医学杂志,1996,31(1):40-41.

[5] 施腾飞，陈惠瑜，洪国粦，等.某院2007-2010年鲍曼不动杆菌的临床分布及耐药性分析[J].检验医学与临床，2011,8(18)：2225-2228.

[6] Hao QR, Wang H,Wang J, et al. Effectively antimicrobial activity of Cbf-k16 and Cbf-A7-A13 against NDM-carrying Escherichia coli by DNA binding after penetrating the cytoplasmic membrane in vitro[J].J Pept Sci,2013,19(3):173-180.

[7] Wang J, Li B, Li Y, et al.BF-30 effectively inhibits ciprofloxacinresistant bacteria in vitro an in a rat model of vaginosis[J].Arch Pharm Res,2013,37(7):927-936.

[8] Alba A,Lopez-Abarrategui C,Otero-Gonzalez A J.Host defense peptides: an alternative as antiinfective and immunomodulatory therapeutics[J].Biopolymers,2012,98(4):251-267.

[9] Hanchen A, Rausch S, Sussmuth R D, et al. Alanine scan of the peptide antibiotic feglymycin: Assessment of amino acid side chains contributing to antimicrobial activity[J].Chembiochem, 2013,14(5):625-632.

[10]Dong XQ,Zhang DM,Chen YK,et al.Effects of antimicrobial peptides (AMPs )on blood biochenmical parameters,antioxidase activity,and immune function in the common carp (Cyprinuscarpio)[J].Fish Shellfish Immunol,2015,47(1):429-433.

[11]Hao QR, Wang H,Wang J,et al. Effectively antimicrobial activity of Cbf-k16 and Cbf-A7-A13 against NDM-carrying Escherichia coli by DNA binding after penetrating the cytoplasmic membrane in vitro[J].J Pept Sci,2013,19(3):173-180.

[12]Boohaker R J,Lee M W,Vishubhotla P,et al.The Use of Therapeutic Peptides to Target and to kill Cells[J].Curr Med Chem,2012,19(22):3794-3804.

[13]Garcia M,Jemal A,Ward E,et al.Global cancer facts &figures 2013[J].Atlanta,GA:American Cancer Society,2013,1(3):49-59.

[14]Southern P，Horbul J，Mather D，et al.C.albicansclonization of human mucosal sufaces[J]．Plos one，2008，3(4)：2067-2071.

Antibacterial Peptide Effect on Fungi for Erosion Type OLP Patients Saliva

GUO Yan, ZHANG Ying

(EmergencyDept.ofStomatol.Mucosa,Affil.Hosp.ofStomatol.,ChinaMed.Uni.Shenyang110001)

It was found through clinical studies that antibacterial peptide has the advantages that antibiotics do not have, and could inhibit and kill fungi in saliva of erosion type OLP (oral lichen planus) patients, and makes up the shortcoming of antibiotics. Inhibition experiment using different concentrations, different kinds of antibacterial peptide, action on strains isolated and identified from oral auto-erosion type OLP patients saliva samples against three common fungi,Candidaalbicans, smooth candida, tropical candida were carried out. The results showed that the numerical comparison, the colony growth, the minimum bacteriostatic values before and after using antibacterial peptides have changed significantly. It was found that the inhibition and killing effects of RISE-AP12 against three common fungi excelled or outwent other antibacterial peptides, and has fairly wide prospect in clinical application.

oral erosion type flat moss;Candida; antimicrobial peptides

郭岩 女，副主任医师，硕士研究生。主要从事口腔内科工作。Tel：024-22892645，E-mail:69055888@qq.com

* 通讯作者。女，主任医师，硕士生导师。主要从事口腔内科研究。Tel: 024-22891863，E-mail:zy_64_04_24@sina.com

2016-04-02；

2016-05-16

Q939.92;R978

A

1005-7021(2016)05-0074-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.013