雷公藤内生真菌Pestalotiopsis disseminata次级代谢产物研究

李 博，王 宇，潘华奇，梁洪玥，赵 楠，陈再兴，刘 涛

(1.中国医科大学药学院天然药物化学教研室，辽宁 沈阳 110122；2.中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳 110016；3.锦州医科大学药学院，辽宁 锦州121000；4.中国医科大学药学院中心实验室，辽宁 沈阳 110122)

雷公藤内生真菌Pestalotiopsis disseminata次级代谢产物研究

李 博1，王 宇1，潘华奇2，梁洪玥3，赵 楠1，陈再兴4，刘 涛1

(1.中国医科大学药学院天然药物化学教研室，辽宁 沈阳 110122；2.中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳 110016；3.锦州医科大学药学院，辽宁 锦州121000；4.中国医科大学药学院中心实验室，辽宁 沈阳 110122)

采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱及PHPLC等手段对雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)内生真菌广布拟盘多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的发酵次级代谢产物进行分离纯化，通过理化性质及波谱学数据分析对化合物结构进行鉴定。结果表明，从内生真菌Pestalotiopsisdisseminata的次级代谢产物中共分离并鉴定了7个单体化合物，分别为7-羟基-5-甲氧基-4,6-二甲基苯酞(Ⅰ)、腺苷(Ⅱ)、尿苷(Ⅲ)、邻苯二甲酸二正丁酯(Ⅳ)、邻苯二甲酸二异丁酯(Ⅴ)、1,1′-二(1,1′-羧基乙基)醚(Ⅵ)、赤藓醇(Ⅶ)，其中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ为首次从该属真菌中分离得到，化合物Ⅰ、Ⅴ为首次从该种真菌中分离得到。

雷公藤；内生真菌；广布拟盘多毛孢；次级代谢产物

植物内生菌是指在健康植物的组织和器官内部度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的菌群，它们可能存在于植物组织内部的任何部位[1-2]，可以通过组织学方法从严格表面消毒的植物组织中分离，或者通过从植物组织内直接扩增出微生物DNA 的方法来获得。药用植物的内生真菌由于和药用植物长期互惠共生，相互协调发展，往往可以产生一些与宿主植物自身代谢产物相同、相似或较为独特的次级代谢产物，并且从这些较为独特的次级代谢产物中往往更容易发现新的活性物质。目前，从药用植物中已获得了大量的内生真菌，有些内生真菌可以产生具有生物活性的天然产物(如喜树碱[3-4]、紫杉醇及长春新碱等[5])，并表现出抗炎[6]、抗癌[7]、免疫抑制[8]及杀虫[9]等多种生物功能。药用植物内生真菌被认为是生物活性次级代谢产物的重要来源之一[10]。

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)又名黄藤、黄藤木、断肠草等，为卫矛科一年生藤本植物，是我国传统常用中药。《中国药用植物志》中记载：其味苦、涩，性寒、有毒，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗生育及免疫调节等药理作用，临床用于治疗系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎[11]、肾炎等自身免疫性疾病[12]。然而，目前关于雷公藤的研究主要集中在化学成分的提取分离及临床应用方面，有关雷公藤内生真菌的研究报道相对较少。

鉴于此，作者采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱及半制备型HPLC(PHPLC)等手段对雷公藤内生真菌广布拟盘多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的发酵次级代谢产物进行研究，并对其结构进行鉴定，以期发现结构新颖的免疫抑制活性化合物。

1 实验

1.1 菌种、试剂与仪器

雷公藤植株，2015年8月采自福建省宁德市柘荣县，经辽宁中医药大学药用植物学教研室许亮教授鉴定为雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)；实验菌种分离自该雷公藤植株，经中国科学院沈阳应用生态研究所潘华奇助理研究员鉴定为广布拟盘多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)真菌，存放于中国医科大学药学院天然药物化学教研室。

Sephadex LH-20型凝胶，英国GE Healthcare 公司；HP-20型大孔吸附树脂，日本三菱公司；柱色谱用硅胶G(100～200目、200～300目)和薄层色谱用硅胶GF254，青岛海洋化工有限公司；常规用试剂均为分析纯；高效液相色谱用试剂为色谱纯。

AVANCE 600型核磁共振仪，德国Bruker公司；HITACHI 1110型半制备型高效液相色谱仪、1410型紫外检测器，日本日立公司；EYELA N-1100型旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社；BSA124S型分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HEQ-F160型振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；DNP-9082型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；SW-CJ-1FD型净化工作台，苏州净化设备有限公司；Sinochrom ODS-BP型色谱柱(10 mm×250 mm，5 μm)，大连依利特分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 发酵

将斜面保藏菌种接种到培养基平板上，28 ℃培养箱中培养3 d；然后将培养基平板切成小块接种到装有200 mL PDA发酵培养基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、150 r·min-1振荡培养10 d，得到发酵液14.6 L。

PDA发酵培养基配制：称取200 g马铃薯，洗净去皮后切成小块，加水1 000 mL煮沸30 min，纱布过滤，在滤液中加入20 g葡萄糖，充分溶解后，分装。

1.2.2 提取分离

将发酵液在8 000 r·min-1下离心15 min，分离菌丝体与发酵液。菌丝体用丙酮超声提取3次，每次1 h，合并提取液，减压回收得到浸膏。发酵液用大孔吸附树脂吸附后，依次用水、15%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，收集95%乙醇洗脱液，减压回收得到浸膏。合并上述两部分浸膏得到粗浸膏53.8 g。粗浸膏经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇(体积比100∶0→0∶100)梯度洗脱，得到10个组分Fr.1～10。Fr.1(1.5 g)经硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯(体积比100∶0→7∶3)梯度洗脱，得到组分Fr.1-1～5，其中Fr.1-3经PHPLC分离，用80%甲醇洗脱，进一步分离纯化得到化合物Ⅳ(8.8 mg)和化合Ⅴ(10.4 mg)；Fr.1-5经PHPLC分离，用80%甲醇洗脱，进一步分离纯化得到化合物Ⅰ(9.8 mg)。Fr.6(2.2 g)经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇(体积比15∶1→1∶1)梯度洗脱，得到组分Fr.6-1～6，其中Fr.6-6经PHPLC分离，用28%甲醇洗脱，进一步分离纯化得到化合物Ⅶ(5.8 mg)和化合物Ⅲ(10.2 mg)。Fr.7(2.8 g)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，得到组分Fr.7-1～6，其中Fr.7-6经PHPLC分离，用30%甲醇洗脱，进一步分离纯化得到化合物Ⅱ(8.5 mg)。Fr.5(1.5 g)经甲醇反复重结晶得到化合物Ⅵ(20.1 mg)。

1.2.3 结构鉴定

通过理化性质及波谱学数据分析对化合物Ⅰ～Ⅶ进行结构鉴定。

2 结果与讨论

从雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)内生真菌广布拟盘多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的发酵次级代谢产物中共分离得到7个化合物，其理性质及波谱学数据如下：

化合物Ⅰ：无色针状结晶(氯仿-甲醇)，10%硫酸乙醇显灰紫色。1HNMR(CDCl3,600 MHz)，δ：7.68(1H,s,7-OH),5.20(2H,s,H-2),3.77(3H,s,5-OCH3),2.20(3H,s,6-CH3),2.14(3H,s,4-CH3);13CNMR(CDCl3,150 MHz)，δ：173.0(C-1),163.8(C-5),153.8(C-7),143.4(C-3),118.5(C-6),116.5(C-4),105.1(C-8),70.1(C-2),60.3(5-OCH3),11.4(4-CH3),8.5(6-CH3)。以上数据与文献[13]基本一致，故确定该化合物为7-羟基-5-甲氧基-4,6-二甲基苯酞(7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalide)。

化合物Ⅱ：白色无定形粉末，紫外照射下有暗斑、无荧光。1HNMR(DMSO-d6，600 MHz)，δ：8.38(1H,s,H-2),8.17(1H,s,H-8),7.37(2H,brs,NH2),5.88(1H,d,J=6.0 Hz,H-1′),5.46(1H,s,H-2′),4.64(1H,brs,H-3′),4.17(1H,brs,H-4′),3.60(1H,d,J=12.0 Hz,H-5′a),3.58(1H,d,J=12.0 Hz,H-5′b)。以上数据与文献[14]基本一致，故确定该化合物为腺苷 (adenosine)。

化合物Ⅲ：白色无定形粉末。1HNMR(DMSO-d6,600 MHz)，δ：11.33(1H,brs,NH),7.91(1H,d,J=8.4 Hz,H-6),5.81(1H,d,J=5.4 Hz H-1′),5.68(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),5.42(1H,brs,OH),5.13(2H,brs,OH),4.06(1H,t,J=6.6 Hz,H-2′),4.00(1H,t,J=6.6 Hz,H-3′),3.87(1H,dd,J=7.2 Hz、3.6 Hz,H-4′),3.65(1H,m,H-5′a),3.58(1H,m,H-5′b)；13CNMR(DMSO-d650 MHz)，δ：163.5(C-4),151.1(C-2),141.1(C-6),102.1(C-5),88.1(C-1′),85.2(C-4′),73.9(C-2′),70.3(C-3′),61.2(C-5′)。以上数据与文献[15]基本一致，故确定该化合物为尿苷(uridine)。

化合物Ⅳ：无色油状物。1HNMR(CDCl3，600 MHz)，δ：7.72(2H,m,H-3,6),7.53(2H,m,H-4,5),4.31(4H,t,J=7.2 Hz,H-1′,1″),1.72(4H,m,H-2′,2″),1.44(4H,m,H-3′,3″),0.96(6H,t,J=7.2 Hz,H-4′,4″)。根据δ7.72(2H,m)和δ7.53(2H,m)处呈现的峰形，推测该化合物可能具有邻位对称取代的苯环结构，构成AA′XX′自旋偶合系统。结合文献[16]数据，确定该化合物为邻苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate)。

化合物Ⅴ：无色油状物。1HNMR(CDCl3，600 MHz)，δ：7.73(2H,m,H-3,6),7.54(2H,m,H-4,5),4.10(4H,d,J=6.6 Hz,H-1′,1″),2.04(2H,m,H-2′,2″),1.00(12H,d,J=6.6 Hz,H-3′,3″,4′,4″)。以上数据与文献[16]基本一致，故确定该化合物为邻苯二甲酸二异丁酯 (diisobutyl phthalate)。

化合物Ⅵ：白色无定形粉末，紫外照射下无暗斑、有荧光，10%硫酸乙醇不显色。1HNMR(DMSO-d6，600 MHz)，δ：6.76(1H,brs,COOH),3.83(1H,brs,H-1,1′),1.22(3H,brs,H-2,2′)；13CNMR(DMSO-d6，150 MHz)，δ：177.1(COOH),68.3(C-1,1′),21.1(C-2,2′)。以上数据与文献[17]基本一致，故确定该化合物为1,1′-二(1,1′-羧基乙基)醚[1,1′-bis(1,1′-carboxyethyl)ether]。

化合物Ⅶ：无色结晶(甲醇)。1HNMR(DMSO-d6,600 MHz)，δ：3.45(2H,m,H-2,3),3.35(4H,m,H-1,4)，均为连氧碳上的氢信号；13CNMR(DMSO-d6,150 MHz)中只有2个碳信号63.42和72.87，由此推测其可能为对称结构。结合文献[18]数据，确定该化合物为赤藓醇(erthyritol)。

化合物Ⅰ～Ⅶ的结构式如图1所示。

图1 化合物Ⅰ～Ⅶ的结构式

3 结论

从雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)内生真菌广布拟盘多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的发酵次级代谢产物中共分离得到7个化合物，分别为7-羟基-5-甲氧基-4,6-二甲基苯酞(Ⅰ)、腺苷(Ⅱ)、尿苷(Ⅲ)、邻苯二甲酸二正丁酯(Ⅳ)、邻苯二甲酸二异丁酯(Ⅴ)、1,1′-二(1,1′-羧基乙基)醚(Ⅵ)、赤藓醇(Ⅶ)，其中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ为首次从该属真菌中分离得到，化合物Ⅰ、Ⅴ为首次从该种真菌中分离得到。

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Secondary Metabolites of Endophytic Fungus Pestalotiopsis disseminata Isolated from ripterygium wilfordii Hook. f.

LI Bo1,WANG Yu1,PAN Hua-qi2,LIANG Hong-yue3,ZHAO Nan1,CHEN Zai-xing4,LIU Tao1

(1.DepartmentofNaturalProductsChemistry,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China;2.InstituteofAppliedEcology,ChineseAcademyofSciences,Shenyang110016,China;3.SchoolofPharmacy,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121000,China;4.CentralLaboratory,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China)

The secondary metabolites ofPestalotiopsisdisseminata,a endophytic fungus isolated fromTripterygiumwilfordiiHook.f.,were isolated and purified through silica gel and Sephadex LH-20 gel column chromatography as well as PHPLC method,and the structures of obtained compounds were identified by physicochemical properties and spectral data.Results showed that,seven compounds which isolated from the secondary metabolites ofPestalotiopsisdisseminatawere identified as 7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalide(Ⅰ),adenosine(Ⅱ),uridine(Ⅲ),dibutyl phthalate(Ⅳ),diisobutyl phthalate(Ⅴ),1,1′-bis(1,1′-carboxyethyl) ether(Ⅵ),erthyritol(Ⅶ),respectively.Compounds Ⅱ,Ⅲ,Ⅵ and Ⅶ were firstly obtained fromPestalotiopsisgenus,and compounds Ⅰ and Ⅴ were firstly found from fungusPestalotiopsisdisseminata.

TripterygiumwilfordiiHook.f.;endophytic fungus;Pestalotiopsisdisseminata;secondary metabolite

国家自然科学基金资助项目(81302672)，辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2013315)

2016-08-17

李博(1987-)，女，辽宁沈阳人，讲师，研究方向：中药及天然药物活性成分和质量控制，E-mail:libo06101409@126.com；通讯作者：刘涛，副教授，E-mail:taoliu0307@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.005

李博，王宇，潘华奇，等.雷公藤内生真菌Pestalotiopsisdisseminata次级代谢产物研究[J].化学与生物工程，2016，33(12)：27-30.

R 284.1

A

1672-5425(2016)12-0027-04