肝素钠对氟尿嘧啶诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的影响探讨

张鹏 吴兰华 左曼 马龙 王彦茹 蒋萍 林素兰

(1.新疆医科大学护理学院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学第一临床医学院；3.新疆医科大学基础医学院)

肝素钠对氟尿嘧啶诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的影响探讨

张鹏1吴兰华2左曼1马龙1王彦茹1蒋萍3林素兰1

(1.新疆医科大学护理学院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学第一临床医学院；3.新疆医科大学基础医学院)

目的 通过观察不同浓度肝素钠对氟尿嘧啶诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的影响，探讨不同浓度肝素钠稀释液及不同作用时相点对氟尿嘧啶致血管内皮细胞损伤的影响及可能的作用机制。方法将体外培养的2～3代HUVECs随机分为对照组、氟尿嘧啶组、肝素钠组，其中对照组只用培养基培养；氟尿嘧啶组用终浓度为25 mg/L的氟尿嘧啶为刺激物；肝素钠组分别以终浓度为12.5 U/mL、25 U/mL、50 U/mL肝素钠稀释液联合终浓度为25 mg/L的氟尿嘧啶为刺激物。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞白介素-6(IL-6)、白介素-1(IL-1)及组织纤维溶酶原激活物(t-PA)含量。结果氟尿嘧啶组IL-6、IL-1及t-PA蛋白表达较对照组升高(P<0.05)；与氟尿嘧啶组相比，肝素钠组可抑制氟尿嘧啶诱导的HUVECs 释放 IL-6、IL-1及t-PA(P<0.05)，以50U/ mL肝素钠组作用最为显著，但IL-6、IL-1及t-PA蛋白表达仍高于对照组(P<0.05)。不同浓度肝素钠组间差异无统计学意义(P>0.05)。同一药物浓度组，与药物作用1 d后相比，第4天、第7天、第14天均有统计学差异(P<0.05)，其中IL-6蛋白表达呈时间依赖性升高。结论肝素钠可抑制内皮细胞释放IL-1、IL-6及t-PA蛋白，对内皮细胞具有一定保护作用。

肝素钠； 氟尿嘧啶； 人脐静脉内皮细胞； 护理

经外周静脉置入中心静脉导管(Peripherally inserted central catheter，PICC)是恶性肿瘤患者化疗的理想输液通路。然而，留置针刺激可诱导内皮细胞凋亡，且随着留置时间延长，内皮细胞凋亡数目逐渐增多，血管损伤加重，加之化疗药物刺激，更易导致静脉炎。有文献报道，留置时间、内皮细胞凋亡、血管损伤三者呈正相关[1]。大量临床研究[2]表明，正确选择封管液是减少中心静脉置管后血管内皮细胞损伤、血栓形成和静脉炎发生的关键。肝素钠稀释液是临床最常用的封管液，但是最佳肝素钠稀释液浓度及不同时相点对血管内皮细胞化学性损伤的保护作用及其作用机制尚不明确。本课题通过体外实验，探讨不同浓度肝素钠稀释液及作用时相点对氟尿嘧啶致血管内皮细胞损伤的影响及可能的机制。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、药物及试剂 HUVECs细胞株购自江阴齐氏生物科技有限公司。胎牛血清购自美国Gibco公司。RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、双抗均购自美国Hyclone。IL-1、IL-6及t-PA蛋白测定试剂盒均购自USCN。6孔板、96孔板购自美国康宁公司。氟尿嘧啶购自上海旭东海普药业有限公司。肝素钠购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 仪器 HF212UV二氧化碳培养箱，Thermo生物安全柜，Leica CTR6000倒置显微镜等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将细胞用含10%胎牛血清、5%青霉素/链霉素溶液(双抗溶液)的M199培养液，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞长至80%～90%融合时，以0.25%胰蛋白酶消化传代，2～3代用于实验。选择对数期生长的细胞，调整细胞浓度为1.0×105cells/mL,接种于96孔板中，每孔200 μL,每组设立3个复孔。待细胞生长至80%融合后，贴壁细胞随机分为3组，倒置显微镜进行形态学观察并摄片。

1.2.2 实验分组

1.2.2.1 对照组 每孔加入200 μL的培养基。

1.2.2.2 氟尿嘧啶组 每孔加入200 μL氟尿嘧啶浓度为25 mg/L的培养基。

1.2.2.3 肝素钠组 以肝素钠与氟尿嘧啶共同孵育。(1)低浓度组：每孔加入200 μL肝素钠浓度为12.5 U/mL，氟尿嘧啶浓度为25 mg/L的培养基。(2)中浓度组：每孔加入200 μL肝素钠浓度为25 U/mL，氟尿嘧啶浓度为25 mg/L的培养基。(3)高浓度组：每孔加入200 μL肝素钠浓度为50 U/mL，氟尿嘧啶浓度为25 mg/L的培养基。每组均孵育14 d，每隔24 h更换新鲜培养液，分别于第1天、第4天、第7天、第14天镜下观察细胞形态学改变并拍照，收集每个孔孵育了24 h的培养液，-80 ℃保存。

1.2.3 酶联免疫吸附双抗体夹心法 分别将IL-1、IL-6及t-PA标准品准确复溶，用稀释液做1.25次倍比稀释，IL-1标准品浓度分别为120 ng/L、80 ng/L、40 ng/L、20 ng/L、10 ng/L，IL-6标准品浓度分别为6 ng/L、4 ng/L、2 ng/L、1 ng/L、0.5 ng/L，t-PA标准品浓度分别为12 ng/L、8 ng/L、4 ng/L、2、1 ng/L。实验其余步骤严格按IL-1、IL-6及t-PA蛋白测定试剂盒说明书操作。以450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线计算出相应的浓度。

2 结果

2.1 HUVECs形态观察 (1)对照组：倒置显微镜下可见细胞呈不规则形，细胞单层融合时呈典型的“铺路石”样外观，随着培养时间增长，细胞数目成“S”形曲线生长。(2)氟尿嘧啶组：细胞培养初期可观察到细胞生长受到抑制，细胞培养至第10天时，倒置显微镜下可见多数细胞死亡，培养至第14天时，细胞全部死亡。(3)肝素钠组：细胞数目增长较慢，细胞不出现融合，50 U/mL肝素钠加25 mg/L氟尿嘧啶组细胞生长相对较好，与其他浓度组相比，细胞数目较多且细胞形态相对完整。

2.2 不同浓度肝素钠对氟尿嘧啶诱导HUVECs分泌IL-1、t-PA及IL-6的影响 对照组HUVECs释放少量IL-1、IL-6及t-PA，氟尿嘧啶25 mg/L刺激后，其IL-1、IL-6及t-PA蛋白表达明显增加，经不同浓度肝素钠干预后，其上清液IL-1、IL-6及t-PA蛋白含量下降，以高浓度肝素钠组(50 U/mL肝素钠稀释液加25 mg/L氟尿嘧啶)作用为著，但仍高于对照组。五组间IL-1含量比较，差异有统计学意义(F=41.055，P<0.01);五组间t-PA含量比较，差异有统计学意义(F=64.516，P<0.01);五组间IL-6含量比较，差异有统计学意义(F=13.091，P<0.01)。见表1。

表1 不同组人脐静脉内皮细胞表达IL-1、IL-6及t-PA的含量比较 (ng/L)

注：与对照组相比，*P<0.05;与氟尿嘧啶组相比，#P<0.05。

3.3 肝素钠在不同时相点对HUVECs释放IL-1、IL-6及t-PA蛋白的影响 以50 U/mL肝素钠稀释液与25 mg/L氟尿嘧啶共同孵育14 d，分别于第1天、第4天、第7天、第14天取24 h培养液，可见随着时间的延长，上清液的IL-1、IL-6及t-PA增高， 14 d达到高峰，且在4、7、14 d各时相点均高于对照组，IL-1、t-PA在第7天与第4天无统计学差异(P>0.05),第14天与第7天有统计学差异(P<0.05);IL-6四个时间点均有统计学意义(F=142.518，P<0.05)。见表2～4。

ng/L

注：与1 d相比，*P<0.01；与4 d相比，#P<0.01；与7 d相比，△P<0.01。

ng/L

注：与1 d相比，*P<0.01；与4 d相比，#P<0.01；与7 d相比，△P<0.01。

ng/L

注：与1 d相比，*P<0.01；与4 d相比，#P<0.01；与7 d相比，△P<0.01。

3 讨论

PICC已经成为肿瘤患者治疗的重要用药通路。然而PICC置管后可导致导管脱出、导管阻塞、血管壁机械性损伤，加之化疗药物的应用，可使血管上皮细胞坏死[3]，更易导致静脉炎。一项临床的随机整群对照研究结果显示：使用3 mL的100 U/mL的肝素溶液冲管比生理盐水冲洗外周静脉套管更有效，原因在于它减少了外周静脉置管后发生静脉炎、堵管、更换置管位置的次数[4]。但是，也有学者认为，低分子肝素具有保护血管内皮的作用，从而在某种程度上可以减轻高凝状态及炎症播散[5]。目前大量的临床和实验研究表明肝素也具有抗炎活性[6]。多项研究表明[7]，肝素抑制促炎因子的释放,包括IL-1β、IL-6、TNF-α、抑制缺血再灌注损伤中NF-κB介导的炎症反应,并通过增加一氧化氮和前列环素的生成减少了内皮细胞功能障碍。本次研究通过检测促炎因子IL-6、IL-1及t-PA的含量，探讨不同浓度肝素钠稀释液及作用时相点对氟尿嘧啶致血管内皮细胞损伤的影响。

本研究结果表明：以不同浓度肝素钠干预氟尿嘧啶作用后的HUVECs，各浓度肝素钠组IL-1、IL-6及t-PA蛋白表达与氟尿嘧啶组比较有显著差异；不同浓度肝素钠组间差异无统计学意义，其中浓度为50 U/mL为主，说明不同浓度肝素钠对氟尿嘧啶诱导HUVECs损伤均具有保护作用，但不同浓度对其影响甚微。同时也印证了夏瑾[8]不同剂量肝素钠无统计学差异，且对无肝素钠使用禁忌的患者用50 U/mL肝素钠封管效果最好的观点。同一药物浓度组，与药物作用1 d后相比，第4天、第7天、第14天均有统计学差异，其中IL-6蛋白表达在一定范围内呈时间依赖性升高，在第14天时，肝素钠组IL-6、IL-1及t-PA的含量远远低于氟尿嘧啶组，提示肝素钠在第14天时仍具有保护内皮细胞的作用，相对延长置管时间。但由于体外实验，细胞存活时间有限，研究至14 d后细胞几乎全部死亡，后期将通过在体实验，进一步研究。

综上所述，肝素钠对氟尿嘧啶诱导HUVECs损伤具有一定保护作用，其机制可能是肝素钠抑制氟尿嘧啶诱导HUVECs分泌IL-1、IL-6等炎性因子。在离体实验中，不同浓度肝素钠均有保护内皮细胞的作用，以50 U/mL肝素钠为著，其相对延长了置管时间。本研究结果为临床上肝素钠封管液浓度的选择及封管时间提供了实验依据。

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The influence of heparin sodium for fluorouracil-based induction of human umbilical vein endothelial cells damage

Zhang Peng1, Wu Lanhua2, Zuo Man1,Ma long，Wang Yanru1, Jiang Ping3, Lin Sulan1

(1.CollegeofNursingofXinjiangMedicalUniversity; 2.TheFirstClinicalMedicalCollegeofXinjiangMedicalUniversity;3.SchoolofBasicMedicalSciencesofXinjiangMedicalUniversity,UrumqiXinjiang830000 )

Objective To detect the mechanism on the effects of different level of heparin sodium on fluorouracil induced expression of interleukin 6 (IL-6) and interleukin 1 (IL-1), tissue fiber dissolving enzyme activators (t-PA), in induction of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods Cultured HUVECs at passage 3 to 6 was randomly divided into control group, fluorouracil group and heparin sodium group, with a final concentration of fluorouracil group is 25 mg/L of fluorouracil for stimulus, heparin sodium group on final concentration of 12.5, 25, 50 μ/ml sodium heparin dilution and the final concentration of 25 mg/L of fluorouracil for stimulus. The protein level of IL-6, IL-1 and t-PA in the cultured medium were measured by enzyme-linked immunosorbent (ELISA).Results Compared to control group, the expression of IL-6, IL-1, t-PA protein increased in fluorouracil group (allP<0.05). Compared to fluorouracil group，heparin can inhibit HUVECs induced by fluorouracil release IL-6, IL-1 and t-PA (P<0.05), with 50 u/ml role for the heparin group, but IL-6, IL-1 and t-PA protein expression is still higher than that of the control group (P<0.05). There was no statistical difference between different concentrations of sodium heparin group (P>0.05). The same drug concentration group, compared with the drug effect after 1 days, 4 days, 7 days, 14 days are statistically significant difference (P<0.05). IL-6 protein expression in time dependence.Conclusion Heparin group inhibits endothelial cells release, IL-6 and IL-1 t-PA protein, possesses certain protective effects on endothelial cells.

Heparin sodium; Fluorouracil; HUVECs； Nursing

2014年新疆维吾尔族自治区级大学生创新项目(编号：CX2014032)

张鹏(1993-)，女，河北，本科，研究方向：肿瘤护理

林素兰，E-mail：linsulan@163.com

R471

A

10.16821/j.cnki.hsjx.2016.03.005

2015-09-31)