血竭生肌膏对糖尿病大鼠基质金属蛋白酶类表达的影响

张东萍，曹建春

实验研究

血竭生肌膏对糖尿病大鼠基质金属蛋白酶类表达的影响

张东萍1，曹建春2

目的：研究血竭生肌膏对糖尿病模型大鼠干预作用，研究其促进糖尿病创面愈合的机制。方法：应用链脲佐菌素腹腔注射法制作糖尿病大鼠模型，通过手术损伤和50%冰醋酸刺激法制作糖尿病性溃疡模型。将大鼠随机分为假手术组、糖尿病性溃疡模型组、中药治疗组、西药对照组，分别给予不同的干预措施，通过免疫组织化学方法检测治疗前后创面基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制物（TIMP）变化。结果：MMP-2在假手术组、模型组、西药组、中药组的表达分别为(0.068 17±0.021 198)、(0.139 33±0.012 094)、(0.081 50±0.011 203)、(0.078 83±0.012 073)；而MMP-9的表达分别为(0.074 83±0.006 969)、(0.138 50±0.028 452)、(0.081 50±0.011 962)、(0.074 83±0.009 663)。假手术组大鼠溃疡创面MMP-2、MMP-9的表达明显低于其它3组（P＜0.01）；模型组大鼠溃疡创面MMP-2、MMP-9的表达明显高于西药组、中药组（P＜0.01），中药组大鼠溃疡创面MMP-2、MMP-9的表达明显低于西药组（P＜0.01）。TIMP-1在假手术组、模型组、西药组、中药组的表达分别为(0.081 33±0.013 307)、(0.069 67±0.008 524)、(0.079 17±0.011 974)、(0.132 50±0.011 415)。假手术组大鼠溃疡创面TIMP-1的表达明显高于模型组、西药组、中药组（P＜0.01），模型组大鼠溃疡创面TIMP-1的表达明显低于西药组和中药组（P＜0.01），中药组大鼠溃疡创面TIMP-1的表达明显高于西药组（P＜0.01）。结论：血竭生肌膏通过抑制糖尿病大鼠溃疡创面MMP-2、MMP-9的表达，提高TIMP-1的表达，从而促进糖尿病溃疡创面的愈合。

血竭生肌膏；糖尿病；大鼠；基质金属蛋白酶

糖尿病足是糖尿病患者致残的主要原因之一，糖尿病足难愈性创面的形成是一个多因素、多环节参与的病理过程，发病机制目前尚不清楚，近年细胞外基质在伤口愈合中的作用逐渐得到重视，而基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs）是调节细胞外基质的重要成分。临床中我们运用中药自制制剂—血竭生肌膏治疗糖尿病足创面700余例，疗效显著。本研究观察血竭生肌膏对糖尿病大鼠足溃疡组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达水平的影响，探讨血竭生肌膏对MMPs系统的调节作用。

1 材料与方法

1.1 动物 Wistar雄性大鼠40只，体质量（220± 10）g，清洁级。北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 仪器 KD-BM生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司。LEICA2016切片机，德国。图像采集采用OLYMPUS BX-41荧光显微镜及NIKON DIGITAL SIGHT彩色CCD。数据分析软件Image Pro Plus6.0，Media Cybernetics公司。

1.3 主要试剂 链脲佐菌素（streptozocin，STZ）美国Sigma公司产品(Sigma-S0130)，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司。50%冰乙酸购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司。

第一抗体：羊抗人MMP-9（Santacruz SC-6840）、兔抗MMP-2（博士德BA0569）、兔抗MMP-1（博士德BA3727）、兔抗VEGF抗体（博士德BA0407）、小鼠抗PCNA抗体（博士德BM0104）。免疫组化染色试剂盒，Histostain-Plus Mouse Primary（Cat.No.85-6643，Invitrogen，USA）。Histostain–PlusRabbit Primary（Cat.No.85-6743，Invitrogen，USA）。试剂A（蓝色液体），封闭用正常山羊血清工作液。试剂B（黄色液体），生物素化二抗工作液。试剂C（橙色液体），辣根酶标记链霉卵白素工作液。DAB Kit（Cat.No.00-2014， Invitrogen，USA）。

1.4 药物 血竭生肌膏由蜈蚣、三七、蜂房、血竭组成，研碎后与凡士林混匀。由北京中医药大学东直门医院药学部提供。

1.5 糖尿病大鼠模型的建立 糖尿病大鼠模型的制作：禁食12 h，采取腹腔一次性注射STZ溶液方法。将150 mg STZ溶于10 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol/L，PH：4.4）中，配制成15 g/L的STZ溶液。大鼠按50 mg/kg一次性腹腔注射。假手术组腹腔一次性注射等体积不含STZ的0.1 mol/L、PH：4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后，以空腹尾静脉全血血糖＞16.65 mmol/L的大鼠为成模大鼠。

1.6 糖尿病大鼠坏疽创面模型的建立 在糖尿病大鼠造模成功后1周，用10%水合氯醛麻醉，按0.33 mL/100 mg体质量注射大鼠腹腔。麻醉，在大鼠腰背部取2×2 cm2正方形区域，脱毛剂脱毛。切除皮肤至浅筋膜，形成缺损性创面。每日用50%冰醋酸涂创面1次，1周后形成缺损性皮肤溃疡大鼠模型。同样方法制作假手术组大鼠创面。

1.7 动物分组与用药 将40只大鼠随机分为4组：假手术组、模型组、中药组、西药组，每组10只。正常饲养1周，以适应新的环境，后注射STZ制作成糖尿病大鼠。

假手术组大鼠创面不予任何药物处理，模型组大鼠创面外涂生理盐水，中药组予血竭生肌膏外涂，西药组外涂重组人表皮生长因子EGF。1次/d，共4周，死亡8只。

1.8 组织学处理 4周后处死大鼠，取创面皮肤及皮下组织，经4%的多聚甲醛0.01 mol/L(PH=7.4)固定液固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。1.9 实验指标 观察动物的进水、饮食、二便排泄及生长、一般状态等情况。免疫组织化学方法检测大鼠创面组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达，采用HPIAS-100高清晰度彩色病理图像分析系统观察免疫组化结果。在染色均匀区选取5个高倍镜视野，计算光密度值。

1.10 统计学处理 计量资料利用计算机统计软件SPSS 11.0中的ANOVA程序进行单因素方差分析，并用LSD程序进行两两比较。

2 结果

2.1 一般情况 大鼠被注射STZ后，第2 d即出现明显的多饮、多食、多尿及粪便增多现象，尤以多饮、多尿最显著。随时间延长，以上症状逐渐加重。至第3周时，模型组出现精神萎靡，行动迟缓，皮毛灰暗无光泽，消瘦，饮水量及小便量为正常大鼠的5～6倍，进食量为正常大鼠的2～3倍。假手术组大鼠则精神良好，行动敏捷，二便正常，体质量持续增长。

2.2 创面组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达假手术组大鼠溃疡创面MMP-2的表达明显低于模型组、西药组、中药组（P＜0.01），模型组明显高于西药组、中药组（P＜0.01），中药组明显低于西药组,见表1、图1。

表1 血竭生肌膏对糖尿病大鼠溃疡创面MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达的影响（光密度值,OD,±s）

表1 血竭生肌膏对糖尿病大鼠溃疡创面MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达的影响（光密度值,OD,±s）

注：同假手术组比较，aP＜0.01;同模型组比较，bP＜0.01;同西药对照组比较，cP＜0.01

组别假手术组模型组西药组中药组n8 8 8 8 MMP-2 0.068 17±0.021 198 0.139 33±0.012 094a0.081 50±0.011 203b0.078 83±0.012 073b、cMMP-9 0.074 83±0.006 969 0.138 50±0.028 452a0.081 50±0.011 962b0.074 83±0.009 663b、cTIMP-1 0.081 33±0.013 307b、c0.069 67±0.008 524 0.079 17±0.011 974b0.132 50±0.011 415a

图1 免疫组化法检测MMP-2在各组创面组织中的表达

图2 免疫组化法检测MMP-9在各组创面组织中的表达

假手术组大鼠溃疡创面MMP-9的表达明显低于模型组、西药组、中药组（P＜0.01），模型组明显高于西药组、中药组（P＜0.01），中药组明显低于西药组。见表1、图2。

假手术组大鼠溃疡创面TIMP-1的表达明显高于模型组、西药组、中药组（P＜0.01），模型组明显低于西药组、中药组（P＜0.01），中药组明显高于西药组。见表1、图3。

3 讨论

糖尿病足是糖尿病的严重并发症，溃疡的发病率约为4%～10%[1]，严重者截肢率高达40%[2]。

糖尿病足溃疡是一种慢性、进行性血管病变，是临床发病率较高的难愈性创面[3-4]。创面修复是一个复杂而有序的生物学过程，许多重要过程均受细胞因子和蛋白酶的调节。研究表明，糖尿病患者足部伤口中，MMPs表达增加，其抑制因子TIMPs表达减少，导致伤口难以愈合。局部应用药物均可通过抑制MMPs促进创面愈合。在正常伤口愈合过程中，许多重要的过程均受生长因子、细胞因子和蛋白酶调节，它们的表达和活性改变可影响伤口愈合[5]。研究发现，在糖尿病足溃疡中，生长因子和其他伤口愈合所需要的介质发生异常[6]，从而影响了伤口愈合。血管、神经和血糖等多重因素导致细胞增殖受抑和胶原代谢障碍，是糖尿病创面延迟愈合的主要原因[7]。因此，研究糖尿病足溃疡发生的分子学基础将使传统的治疗得以发展，并将降低糖尿病足的患病率、截趾/肢率和致残率。

图3 免疫组化法检测TIMP-1在各组创面组织中的表达

糖尿病患者皮肤易受损失，且损失后创面愈合延迟或不愈合。以前研究认为[8-10]，糖尿病合并创面难愈可能与以下因素有关：⑴糖代谢紊乱及晚期糖基化终末产物增多，后者可以干扰内皮细胞与白细胞间的相互作用，使单核巨噬细胞功能受抑制，并抑制内皮细胞增殖。⑵微血管改变，表现为广泛的小血管内皮增生及毛细血管基底膜增厚，引起血流量减少，局部出现缺血、缺氧。⑶基质MMPs在糖尿病患者致伤前后的表达异常。MMPs是降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重要的一类蛋白水解酶，几乎能降解ECM的所有成分。致伤初期，MMPs过少不利于清除伤口中的异物，而后期MMPs过度表达，不利于胶原和基质形成。⑷表皮生长因子受体的改变，表皮生长因子受体激活后能促进有丝分裂或诱导细胞调亡，增加细胞活性，促进蛋白质分泌，诱导细胞分化或细胞去分化。⑸表皮细胞增殖障碍。在创伤愈合过程中，创面的再上皮化依赖于表皮细胞的增殖等生物学行为的正常发挥。由此可见，糖尿病创面难愈的机制很复杂，目前对其研究颇多。

表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）是一种用于促进溃疡愈合的重要生长因子。EGF最早是在1962年从小鼠颌下腺中纯化神经生长因子时被发现的，EGF及受体存在于除造血组织以外的所有组织，其生理功能十分广泛。研究证实，EGF能促进上皮细胞、中性粒细胞、成纤维细胞等多种细胞向创面迁移，提供组织再生与修复的基础。EGF还可以促进血管形成及上皮再生，改善局部血运不足的状态，对慢性溃疡创面有治疗作用。故本研究以EGF为对照观察药物。

研究显示，在发生糖尿病足部溃疡之前的糖尿病患者，血清MMP-9水平较健康对照组就已升1.5倍，到糖尿病足溃疡阶段，血清MMP-9水平高出健康对照组7倍。与糖尿病皮肤及溃疡创面中MMP的表达有相似规律[11-12]。MMP-9在未发生糖尿病足溃疡前升高，细胞外基质过度分解，皮肤防御功能下降。一旦出现急性伤口，可能促使浅溃疡向深、广发展，瘢痕组织无法形成，上皮迁移和角质化过程明显抑制，最终结果导致溃疡经久不愈[13-14]。以健康对照组血清MMP-9水平作为参照，糖尿病患者血清MMP-9升高，患糖尿病足溃疡的风险是非升高者的20倍。近年来的研究发现，MMP-9在糖尿病合并大血管及微血管并发症患者的血清水平升高[15]。

血竭，性味甘、咸、平，具有活血散瘀、定痛、止血生肌等功效，常用于疮疡不敛。《新修本草》：“主五脏邪气，带下，心痛，破积血，金疮生肉。”露蜂房，性味甘平，主治疮疡肿毒，瘰疬，顽癣瘙痒等。蜈蚣，性味辛温，治疗疮疡肿毒，瘰疬痰核。三七，性味甘、微苦，温，具有散瘀止血，消肿定痛等功效。四药合用，起到活血生肌作用，促使创面愈合。

本研究发现，与假手术组比较，糖尿病性溃疡模型组大鼠溃疡创面MMP-2、MMP-9的表达明显升高，而糖尿病性溃疡模型组大鼠溃疡创面TIMP-1的表达明显低于西药对照组、中药治疗组，差异极显著。而血竭生肌膏治疗组大鼠溃疡创面MMP-2、MMP-9的表达明显低于模型组及西药对照组，中药治疗组大鼠溃疡创面TIMP-1的表达明显高于西药对照组。TIMPs是一组能抑制MMPs活性的多功能因子家族，广泛分布于体内各种组织和体液中。我们认为，中药血竭生肌膏通过抑制糖尿病大鼠溃疡创面MMP-2、MMP-9的表达，提高TIMP-1的表达，从而促进糖尿病溃疡创面的愈合，可能是中药促使糖尿病足溃疡愈合的机制之一。

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（收稿：2016-01-22 修回：2016-09-20）

（责任编辑 刘洪斌）

Effect of XueJieShengJi Ointment on Matrix Metalloproteinases Expression in Diabetic Rats

ZHANG Dong-ping,CAO Jian-chun
Department of Vascular Surgery,Dongzhimen Hospital Affiliated Beijing University of Chinese Medicine,Beijing(100078),China

Objective To study the effect of XueJieShengJi ointment on matrix metalloproteinases expres⁃sion in diabetic rats.MethodsDiabetic rat model was made by intraperitoneal injection of streptozotocin,and the diabetic ulcer model was induced by surgical injury and 50%glacial acetic acid stimulation.The rats were randomly divided into sham operation group,diabetic ulcer model group,chinese medicine treatment group and western medicine group(control group),and were given different interventions.Wound matrix metalloproteinases changes were assessed by immunohistochemical method before and after the treatment.ResultsThe expres⁃sion of MMP-2 in sham operation group,model group,control group,Chinese medicine group were（0.068 17± 0.021 198）,（0.139 33±0.012 094）,（0.081 50±0.011 203）,（0.078 83±0.012 073）,respectively.The expres⁃sion of MMP-9 in sham operation group,model group,control group,Chinese medicine group were（0.074 83± 0.006 969）,（0.138 50±0.028 452）,（0.081 50±0.011 962）,（0.074 83±0.009 663）,respectively.The expres⁃sion of MMP-9 and MMP-2 in the sham operation group was significantly lower than that of model group,con⁃trol group,and Chinese medicine group(P＜0.01),The expression of MMP-9 and MMP-2 in ulcers of model group rats was significantly higher than that of con⁃trol group and Chinese medicine group(P＜0.01). In Chinese medicine group,MMP-2 and MMP-9 ex⁃pression was significantly lower than in control group (P＜0.01).TIMP-1 in sham operation group,modelgroup,control group,traditional Chinese medicine group were（0.081 33±0.013 307）,（0.069 67±0.008 524）,（0.079 17±0.011 974）,（0.132 50±0.011 415）,respectively.The expression of TIMP-1 in the sham operation group was significantly higher than in the model group,control group and Chinese medicine group(P＜0.01). The expression of TIMP-1 in the model group was significantly lower than in control group and Chinese medi⁃cine group(P＜0.01).In Chinese medicine group,TIMP-1 expression was significantly higher than in control group(P＜0.01).ConclusionXueJieShengJi ointment improves ulcer recovery in diabetic rats by inhibiting the expression of MMP-2 and MMP-9 and increasing the expression of TIMP-1.

XueJieShengJi ointment;diabetic rats;matrix metalloproteinases

Q95-33;R587.2

A

1007-6948(2016)06-0571-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.06.015

北京中医药大学2015年度基本科研业务费中青年教师项目(2015-JYB-JSMS073)

1.北京中医药大学东直门医院血管外科（北京 100700）

2.北京中医药大学东方医院周围血管科（北京 100078）

曹建春，E-mail:caojianchun02@163.com