miR-34a通过Notch信号通路影响乳腺癌细胞的生物学行为

王雷

(河南大学附属淮河医院甲状腺乳腺外科，河南 开封 475001)



研究报告

miR-34a通过Notch信号通路影响乳腺癌细胞的生物学行为

王雷

(河南大学附属淮河医院甲状腺乳腺外科，河南 开封 475001)

目的探讨miR-34a通过Notch信号通路影响乳腺癌细胞的生物学行为。方法乳腺癌细胞MCF-7分为miR-34a及Control组，分别利用脂质体转染miR-34a mimics及miR-34a NC，RT-PCR法检测细胞中miR-34a表达，MTT、Hoechst染色及transwell法分别检测细胞活力、凋亡及侵袭情况；western blot检测细胞中Notch1，Notch2，Dll1及Jagged-1蛋白表达情况。结果与Control组比较，miR-34 mimics组中miR-34a表达量上调，细胞皱缩，变圆变亮，细胞活力降低(P<0.01)，细胞凋亡率显著提高(P<0.01)，细胞侵袭数目减少(P<0.01)，Notch1，Notch2，Dll1及Jagged-1蛋白表达量都显著降低(P<0.01)。结论miR-34a mimics通过抑制Notch信号通路进而诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡并抑制其侵袭。

miR-34a；Notch信号通路；乳腺癌细胞MCF-7；apoptosis；侵袭

乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一，其死亡率均女性恶性肿瘤第二位，且死亡率在全国甚至全世界范围均呈上升趋势[1-2]。近年来随着化疗，放疗及生物技术手段的普及，乳腺癌患者的预后得到很大改善，但其发病率及难治率还是居高不下，因此寻找有效的诊断及治疗方法一直是乳腺癌等肿瘤研究的重点[3-4]。Notch是美国著名遗传学家Thomas于1917年在果蝇的研究中发现并命名的，并于1980年克隆成功。Notch信号通路包括Notch受体(Notch1，Notch2，Notch3，Notch4)，Dell-like配体(Dell1，3,4)及Jagged配体(Jagged-1，Jagged-2)。研究已经表明Notch信号通路的异常表达与乳腺癌的发生发展密切相关，同时针对Notch信号通路的抑制剂或单克隆抗体已逐渐应用于乳腺癌的治疗中[5-7]。

miRNA是一类内源性非编码的RNA分子，长度约为19-23 nt，能与下游靶基因mRNA的3’端非编码区结合，进而调控靶基因的转录，最终影响细胞的生物学行为。研究已经表明Notch1是miR-34a的下游靶基因之一，miR-34a能通过负性调控Notch1表达进而抑制结肠癌SW480细胞，膀胱癌细胞T24细胞的增殖[8-9]。而miR-34a是否能够通过负性调控Nothc1表达，同时调控Notch信号通路其它蛋白表达进而影响乳腺癌MCF-7细胞生物学行为还尚未见报道，因此本研究将探讨miR-34a对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为及Notch信号通路的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人乳腺癌细胞MCF-7购于中国科学院上海细胞库。

1.1.2 试剂

兔抗Notch1，Notch2，Dll1及Jagged-1多克隆抗体(美国Abcam公司)；四甲基偶氮唑盐(美国Gibco公司)；胎牛血清，transwell试剂盒(美国Hyclone公司)；小鼠抗GAPDH单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，BCA试剂盒，Hoechst 33258染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；LipofectamineTM2000，trizol试剂盒，一步法RT-PCR试剂盒(大连宝生生物有限公司)；miR-34a mimics及miR-34a NC(广州市锐博生物科技有限公司)。

1.1.3 仪器

迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪(北京六一仪器厂)；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；TS100倒置显微镜(日本Nikon公司)；SMA2000型微量紫外分光光度计(美国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染

当MCF-7细胞汇合度达到50%左右时候，利用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒分别转染miR34a NC(Control)、miR-34a mimics，6 h以后换成含10%血清的DMEM培养基；37℃，CO2培养箱培养48 h。应用RT-PCR检测细胞中miR-34a的表达。

1.2.2 RT-PCR检测细胞中miR-34a表达

参考trizol试剂盒使用说明书提取总RNA，并用微量紫外分光光度计检测RNA的纯度，通过一步法RT-PCR试剂盒将逆转录RNA，并进行PCR扩增，最后将扩增产物用于2%的琼脂糖胶电泳。引物分别加入25 μL PCR反应体系中，反应条件为94℃变性45 s，59℃复性45 s，72℃延伸60 s，共35个循环。

1.2.3 MTT法检测细胞活力

将MCF-7细胞接种于96孔板，按“1.2.1”进行转染。分别培养24、48、72、96 h后，于倒置显微镜下拍照，接着加入20 μL终浓度为5 mg/mL 的MTT，继续培养4 h后，将上清液舍弃，并每孔加入150 μL的二甲基亚砜，震荡使结晶物充分溶解，于酶标仪560 nm处测OD值，OD值即代表细胞活力。

1.2.4 Hoechst染色检测细胞凋亡

将MCF-7细胞接种于6孔板，按“1.2.1”进行转染。48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集细胞，后按照Hoechst 33258染色试剂盒说明书进行操作，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，加入Hoechst 33258染色液避光染色15 min，PBS洗涤3次，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.5 transwell法检测细胞侵袭能力

将基质胶均匀平铺于Transwell小室的微膜(8 μm)上，制成凝胶备用。将MCF-7细胞接种于6孔板，按“1.2.1”进行转染。48 h后，将消化下来的细胞接种到Transwell上室，而下室加入含5%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养24 h，取出Transwell小室，洗涤，下室用多聚甲醛固定，结晶紫染色，倒置光学显微镜下计数5个视野穿膜细胞个数，计算平均每个视野的细胞数，即表示细胞的侵袭能力。每组实验重复3次。

1.2.6 Western blot检测细胞中Notch1蛋白表达

将MCF-7细胞接种于6孔板，按“1.2.1”进行转染，48 h收集细胞，加入细胞裂解液，裂解30 min后，离心收集上清液，即可获得总蛋白。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1-2 h，后湿法转膜30-50 min。将膜浸入一抗溶液(兔抗Notch1、Notch2，Dll1及Jagged-1多克隆抗体，小鼠抗GAPDH单克隆抗体，稀释比例：1∶100)孵育，4℃过夜；次日二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，稀释比例：1∶200)室温孵育1 h。并在膜上滴加化学曝光液，于凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件分析各抗体条带灰度值。

1.2.9 统计学分析

2 结果

2.1 miR-34a转染效果的检测

如图1所示，与对照组比较，miR-34a mimics组中miR-34a表达量显著提高，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 miR-34a mimics对MCF-7细胞活力的影响

如图2所示，在作用24、48、72、96 h时，与对照组比较，miR-34a mimics组细胞活力显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。且在48、72、96 h时作用强度一致，因此选择48 h作为后续研究作用时间。同时在48 h倒置显微镜下观察到miR-34a mimics组较对照组细胞皱缩，变圆变亮(图3)。

图3 miR-34a mimics对MCF-7细胞形态的影响(×20)Fig.3 Effect of miR-34a mimics on MCF-7 cell morphology(×20)

2.3 miR-34a mimics对MCF-7细胞凋亡情况的影响

如图4，Hoecsht染色结果所示，与对照组(3.73±0.37)比较，miR-34a mimics组(39.98±4.03)细胞凋亡率显著提高，差异具统计学意义(P<0.01)。

图4 miR-34a mimics对MCF-7细胞凋亡情况的影响(×20)Fig.4 Effect of miR-34a mimics on MCF-7 cell apoptosis (×20)

2.4 miR-34a mimics对MCF-7细胞迁移侵袭能力的影响

如图5，transwell染色结果所示，与对照组(128.42±10.35)比较，miR-34a mimics组(35.71±3.58)细胞凋亡率显著提高，差异具统计学意义(P<0.01)。

图5 miR-34a mimics对MCF-7细胞迁移侵袭能力的影响(×20)Fig.5 Effect of miR-34a mimics on MCF-7 cell invasion viability (×20)

2.5 miR-34a mimics对MCF-7细胞中Notch信号通路的影响

如图6所示，与对照组比较，miR-34a mimics组中Notch1、Notch2，Dll1及Jagged-1表达量显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.01)。

图6 miR-34a mimics对MCF-7细胞中Notch信号通路的影响，与对照组比较，**P<0.01。Fig.6 Effect of miR-34a mimics on Notch signal pathway in MCF-7 cell, compared with control group, **P<0.01.

3 讨论

自1993年Ambros和Ruvkun在秀丽线虫中第一次发现miRNA，即lin-4，科学家对于miRNA的研究已有二十几年时间了，总共发现了6000多种的miRNA分子，在人类基因上就发现了600多种的miRNA。研究发现miRNA通过结合于其靶基因mRNA的3’-UTR区域，通过调控靶基因的转录，参与多种肿瘤细胞的生长，增殖，凋亡，分化，迁移，侵袭及血管生成等生物学行为[10-11]。miR-34a是其中一类被认为具有抑癌基因作用的miRNA，广泛存在于节肢动物及哺乳动物之中，包括三个同源基因，miR-34a，miR-34b，miR-34c。后两种miRNA除了表达于肺组织外，其它正常组织中几乎不表达，而miR-34a几乎表达于所有正常组织中，所以常作为miR-34家族典型miRNA进行研究探讨[12]。研究表明miR-34a不仅仅在乳腺癌中低表达或缺失，在肺癌，肝癌，卵巢癌，膀胱癌，结肠癌等组织中表达量均处于下调状态甚至缺失，所以miR-34a被认为是乳腺癌，卵巢癌等多种肿瘤发生发展及预后的有效检测指标[13-15]。

1917年美国著名遗传学家Thomas在研究果蝇功能时发现果蝇部分功能缺失导致果蝇翅膀边缘产生缺口，因此将造成此缺口的基因命名为Notch，并于1980克隆成功。此信号通路包括4种受体(Notch1，Notch2，Notch3，Notch4)，2类配体，分别为Delta-like样配体(Dll1，Dll3及Dll4)及Serrate样配体(Jagged-1，Jagged-2)。Notch信号通路通过其受体配体结合并扩大信号传递，使相邻细胞间分子之间产生差异，最终决定了乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤细胞的命运，在乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。研究显示在乳腺癌中Notch信号通路异常激活，而针对此信号通路的抑制剂如γ-分泌酶抑制剂或者单克隆抗体联合化疗已在逐步的用于乳腺癌的治疗当中[5-7]。

同时研究也显示Notch信号通路的受体之一Notch1是miR-34a的靶基因之一，miR-34a过表达后能通过下调Notch1表达从而抑制膀胱癌细胞，结肠癌细胞的增殖[8-9]。此外Li等[16]研究也表明miR-34a过表达不仅能下调Nothc1表达，也能下调Notch2表达，同时还能调控细胞周期相关蛋白表达，从而抑制神经胶质瘤细胞的增殖。Pang等[17-18]研究表明miR-34a mimics通过下调Notch1，Dll1及Jagged-1表达，进而抑制绒毛膜癌细胞BeWo及JEG-3的增殖及侵袭，并利用siRNA Notch1及Dll1单克隆抗体进一步验证了miR-34a对细胞增殖侵袭的抑制作用，至少部分抑制作用是通过Notch1及Dll1实现的。所以本研究将在此基础上探讨miR-34a是否也能够通过Notch信号通路影响乳腺癌细胞MCF-7增殖，凋亡与侵袭。首先本研究利用脂质体转染miR-34a mimics及miR-34a NC，并采用RT-PCR证实了转染的成功。接着MTT法检测了miR-34a mimics在24、48、72、96 h对MCF-7细胞活力的影响，结果表明随着作用时间的推移，miR-34a mimics能显著的降低MCF-7细胞活力，不过在48、72、96 h时候抑制程度趋向一致，因此选为后续实验时间。接着采用Hoechst染色进一步验证了miR-34a mimics对MCF-7细胞的凋亡诱导作用，与miR-34a mimics在其它肿瘤细胞中的作用效果一致[8, 9]。另外transwell结果也显示miR-34a mimics能显著的抑制MCF-7细胞的侵袭能力。最后通过western blot检测miR-34a mimics对MCF-7细胞中Notch信号通路的影响，结果表明miR-34a mimics能显著的下调Notch1，Notch2，Dll1及Jagged-1表达，与Pang等[17-18]研究结果一致，从而提示miR-34a mimics能通过抑制Notch信号通路从而诱导MCF-7细胞凋亡，并抑制细胞增殖及侵袭。

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Effect of miR-34a on the biological behavior of breast cancer cell by Notch signal pathway

WANG Lei

Thyroid and breast surgery, Huaihe Hospital Affiliated to Henan University,Kaifeng,Henan,475001 China

Objective To explore effect of miR-34a on the biological behavior of breast cancer cell MCF-7 by Notch signal pathway. Methods The MCF-7 cells were divided into miR-34a and Control groups. The miR-34a mimics and miR-34a NC were transfected by liposome. The expression of miR-34a in MCF-7 cell was examed by RT-PCR. The cell viability was detected by MTT. The cell apoptosis was examed by Hoechst staining. The cell invasion was detected by transwell method. The expression of Nothch1, Nothc2, Dll1 and Jagged-1 was detected by western blot. Results Compared with Control group, the expression of miR-34a was up-regulated (P<0.01), Cell shrinkage, rounded brighten，the cell viability was decreased (P<0.01), cell apoptotic rate was increased (P<0.01), cell invasion number was reduced (P<0.01), the expression of Notch1, Nothc2, Dll1 and Jagged-1 was down-regulated (P<0.01). Conclusion miR-34a mimics induced MCF-7 cell apoptosis and inhibited cell invasion via inhibition of Notch signal pathway.

miR-34a; Notch signal pathway; breast cancer cell MCF-7; apoptosis; invasion

王雷(1982-)，男，研究方向：甲状腺乳腺外科，E-mail:54206653@qq.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0061-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.011

2016-07-28