presenilin-1/presenilin-2双基因敲除小鼠的寿命观察

唐 红，唐晓琴，邓 飞，李 昕，陈 波，唐明希，阮思蓓

(1.西南医科大学附属医院病理科，四川 泸州 646000；2.南方医科大学附属深圳医院病理科，广东 深圳 518102；3.西南医科大学神经解剖教研室，四川 泸州 646000)



研究报告

presenilin-1/presenilin-2双基因敲除小鼠的寿命观察

唐 红1，唐晓琴1，邓 飞2，李 昕1，陈 波3，唐明希1，阮思蓓1

(1.西南医科大学附属医院病理科，四川 泸州 646000；2.南方医科大学附属深圳医院病理科，广东 深圳 518102；3.西南医科大学神经解剖教研室，四川 泸州 646000)

目的观察Presenilin-1/Presenilin-2 双基因敲除小鼠(dKO mice)的生存曲线，为进一步繁殖及使用该模型对阿尔茨海默病(AD)进行研究提供实验设计等提供参考。方法将dKO mice雌性50只，雄性30只，及野生型同系小鼠雌、雄各20只分为4组，观察正常喂养情况下4组间小鼠2年以内各自的生存情况及寿命，绘制生存曲线进行生存分析。结果dKO mice随着时间的延长，雌、雄性生存概率分别低于野生型雌、雄性小鼠，差异均有统计学意义(P<0.001，P<0.001；P<0.001；P<0.001)；dKO mice雌、雄性之间的生存概率差异无统计学意义。结论条件性敲除presenilin-1与presenilin-2 双基因可能会缩短小鼠的寿命，其生存概率显著低于野生型小鼠，而dKO mice雌、雄性之间的生存概率则无统计学差异。本实验结果可为借助此模型的实验设计应用提供有益参考。

dKO mice；条件性基因敲除；小鼠；寿命

早老素1(presenilin-1，PS1)基因与早老素2(presenilin-2，PS2)基因分别位于14号染色体和1号染色体上，其基因突变是引发家族型阿尔茨海默病(familial Alzheimer’s disease，FAD)的重要原因之一[1-3]。研究发现，PS1/PS2双基因敲除小鼠(dKO mice)模型具有年龄依赖性的一系列类似阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的神经退行性病症，如神经元变性、坏死、胶质增生及后期的痴呆行为等[3-5]。本研究通过观察dKO mice的生存曲线，以期对该模型的生存期有更进一步的了解，对实验动物选择、繁殖，以及应用本模型对AD研究的实验设计等提供有益参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

亲代小鼠(基因型为fPS1/fPS1，PS2-/-，Cre+/-)由美国Ya-Ping Tang教授(Louisiana State University，USA)惠赠，品系为B6CBAF1，利用Cre/loxP系统，即Cre的启动子α钙调蛋白激酶Ⅱ，来驱动Cre在整个前脑兴奋性神经元的特异性表达，但γ-氨基丁酸 (GABA)能神经元并不表达Cre，因此PS1在此神经元里并没被敲除，这种将前脑中的PS1基因进行特异性敲除称为条件性敲除，所得杂合子与基因打靶技术将PS2基因进行全身性敲除所得杂合子杂交而来[5]。子代dKO mice的繁殖与基因型鉴定如我们报道所述[6]。动物分组：基因型鉴定合格的实验组dKO mice雌性50只、雄性30只，对照组野生型同系小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司【SCXK(沪)2013-0016】)雌、雄各20只。

1.2 实验环境

实验动物饲养于西南医科大学实验动物中心SPF级屏障设施内【SYXK(川)2013-065】，每盒不超过4只，温度控制在(18～22)℃，湿度控制在40%～60%，12 h/12 h光照周期，全程喂饲成都达硕实验动物有限公司生产的SPF级大小鼠生长繁殖饲料。鼠盒、垫料、饲料及饮水均经过高温高压灭菌处理，每周更换鼠盒及垫料2次，保证充足的饲料和饮水，饲养过程严格按照屏障设施SOP操作。

1.3 观察方法

dKO mice和野生型小鼠按性别分笼饲养，生存时间以小鼠的出生时间为观察起点，观察每只小鼠自然衰老的过程及生存到2年时的死亡情况，记录出生日期及自然死亡日期，并绘制生存曲线。在规定实验的时间内仍然存活的数据为删失数据。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0软件处理数据，生存时间以中位生存时间表示，采用非参数估计法Kaplan-Meier法(K-M法)进行生存分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雌性dKO mice和雌性野生型小鼠生存曲线的比较

实验期间，雌性野生型小鼠有4只由于打架受伤等原因死亡，实验组有45只不明确切原因死亡。对雌性dKO mice和雌性野生型小鼠的生存情况进行统计分析，两种小鼠的删失情况如(表1)所示。雌性dKO mice生存概率随着时间的延长逐渐降低，显著低于雌性野生型小鼠的生存概率(χ2=33.737，P<0.001)。两种小鼠的生存曲线如(图1)所示。

2.2 雌性dKO mice和雄性野生型小鼠生存曲线的比较

实验期间，雄性野生型小鼠有3只由于打架受伤等原因死亡。对雌性dKO mice和雄性野生型小鼠的生存情况进行统计分析，两种小鼠的删失情况如(表2)所示。经比较雌性dKO mice生存概率低于雄性野生型小鼠的生存概率，两种小鼠的生存时间存在显著差异(χ2=34.486，P<0.001)。两种小鼠的生存曲线如(图2)所示。

表1 雌性dKO mice和雌性野生型小鼠删失情况Tab.1 Case processing summary of female dKO mice and female wild-type mice

表2 雌性dKO mice和雄性野生型小鼠删失情况Tab.2 Case processing summary of female dKO mice and male wild-type mice

图1 雌性dKO mice和雌性野生型小鼠生存曲线比较Fig.1 Survival curves of female dKO mice and female wild-type mice

图2 雌性dKO mice和雄性野生型小鼠生存曲线比较Fig.2 Survival curves of female dKO mice and male wild-type mice

2.3 雄性dKO mice和雌性野生型小鼠生存曲线的比较

实验期间，雄性dKO mice有26只不明确切原因死亡。对雄性dKO mice和雌性野生型小鼠的生存情况进行统计分析，两种小鼠的删失情况如(表3)所示。经比较雄性dKO mice生存概率显著低于雌性野生型小鼠的生存概率(χ2=25.971，P<0.001)，两种小鼠的生存曲线如(图3)所示。

图3 雄性dKO mice和雌性野生型小鼠生存曲线比较Fig.3 Survival curves of male dKO mice and female wild-type mice

2.4 雄性dKO mice和雄性野生型小鼠生存曲线的比较

对雄性dKO mice和雄性野生型小鼠的生存情况进行统计分析，两种小鼠的删失情况如(表4)所示。经比较雄性dKO mice生存概率低于雄性野生型小鼠的生存概率，两种小鼠的生存时间差异具有统计学意义(χ2=28.278，P<0.001)。两种小鼠的生存曲线如(图4)所示。

图4 雄性dKO mice和雄性野生型小鼠生存曲线比较Fig.4 Survival curves of male dKO mice and male wild-type mice

表3 雄性dKO mice和雌性野生型小鼠删失情况Tab.3 Case processing summary of male dKO mice and female wild-type mice

表4 雄性dKO mice和雄性野生型小鼠删失情况Tab.4 Case processing summary of male dKO mice and male wild-type mice

表5 不同性别的dKO mice删失情况Tab.5 Gender difference of case processing summary in the dKO mice

图5 不同性别dKO mice生存曲线比较Fig.5 Gender difference of survival curves in the dKO mice

2.5 dKO mice不同性别的生存曲线比较

对不同性别的dKO mice生存情况进行比较，删失情况如(表5)所示。雌性dKO mice中位生存时间为542 d、雄性为583 d，经比较不同性别之间dKO mice的生存曲线无统计学差异(χ2=1.892，P=0.169)。不同性别dKO mice的生存曲线如(图5)所示。

3 讨论

在对AD进行研究过程中，由于人脑组织获得的困难性决定了利用动物模型的重要性，尤其针对像AD等与年龄相关的神经退行性病变的研究更为重要。研究表明，敲除PS1基因的小鼠将出现严重的发育缺陷以及胚胎致死，而利用Cre/loxP系统将前脑中的PS1基因进行条件性敲除的小鼠可以存活和繁殖；而敲除PS2基因的小鼠仅表现出轻微的肺纤维化[4-5]。本实验所用的亲代小鼠如Feng R等[5]所述，将前脑中的PS1基因进行条件性敲除的小鼠与PS2基因敲除的小鼠杂交得到，该动物模型存活情况良好，虽然脑中缺乏Aβ的沉积，但表现出AD样神经退行性疾病的其他表型，如学习记忆能力下降、认知功能减退、大脑皮质与海马萎缩、侧脑室和第三脑室的扩大、大量神经元凋亡、以及神经元内tau蛋白高度磷酸化等[3,6]。dKO mice的成功繁殖与饲养是利用其作为研究AD动物模型的基础，对其寿命的了解是顺利进行AD研究，尤其对其晚期(≥18月龄)的发病机制研究及药物干预等试验设计具有重要的参考价值。

基因敲除小鼠是把小鼠的一个或几个基因敲除后，培养出用于基础及临床实验的动物模型，从而更全面的模仿、认识以及研究人类疾病。在利用动物模型进行人类疾病研究的同时，对其生存、行为、代谢等研究也不容忽视[7]。动物的寿命因种别、品系不同而长短不一，敲除不同的基因对小鼠寿命的影响也可能会不同。Su N等[8]发现条件性敲除成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因会导致小鼠的寿命缩短；Hellekant G等[9]通过对钙稳态调节蛋白1(CALHM1)基因研究发现，敲除CALHM1基因的小鼠生存时间比野生型小鼠长近1年的时间；Kawai H等[10]研究发现敲除GD3合酶基因对小鼠的发育和寿命都没有影响。敲除双基因对小鼠的寿命也可能会有影响，如Koval M等[11]发现敲除小鼠内皮细胞的连接蛋白Cx40 和Cx43基因会导致小鼠肺自发性功能障碍和纤维化，使其寿命明显缩短。本实验通过观察dKO mice和野生型小鼠的生存状况，发现dKO mice中位生存时间雌性为542 d，雄性为583 d，随着时间的延长，雌、雄性dKO mice生存概率逐渐降低，均分别显著低于雌、雄性野生型小鼠的生存概率(P<0.001；P<0.001；P<0.001；P<0.001)，而dKO mice不同性别之间的生存曲线无统计学差异。

可见，敲除presenilin-1/-2 双基因可能会缩短小鼠的寿命，但对其不同性别间的影响无明显差别。此信息有助于我们利用此模型对AD，尤其是对于大于18月龄的dKO mice(晚期AD)动物实验的实验设计等具有重要的参考价值。当然，在自然状态下，雌、雄小鼠共同生活，有两性间的亲密接触、情感交流及相互依赖，还会发生交配、繁殖生育、哺乳等不同情况，而本实验中的dKO mice和野生型小鼠均按性别分笼饲养，与自然状态下有所不同，这些都有可能对小鼠，尤其对dKO mice的病情及寿命可能会有一定的影响。另外，我们的实验设计数量不是很多，这也有可能对实验结果产生一定影响。因此，在今后的工作中对于dKO mice的生存情况有待进一步观察与研究。

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Investigation on life span of presenilin-1/presenilin-2 conditional double knockout mice

TANG Hong1,TANG Xiao-qin1, DENG Fei2, LI Xin1,CHEN Bo3, TANG Ming-xi1, RUAN Si-bei1

(1.Department of Pathology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Sichuan Luzhou 646000, Chian; 2.Department of Pathology, the Affiliated Shenzhen Hospital of Southern Medical University, Guangdong Shenzhen 518102, Chian; 3.Department of Anatomy, Southwest Medical University, Sichuan Luzhou 646000, China)

Objective To analyze the survival curves of presenilin-1/presenilin-2 conditional double knockout mice (dKO mice), and provide a reference for further breeding of this strain of mice and studying the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Methods dKO mice (50 females and 30 males) and wild-type controls (20 females and 20 males) were included in this study. The survival of all the mice was observed under the same condition of feeding and nutrition for two years. Life span of each mouse was calculated, survival curves were drawn, and their survival was analyzed. Results With the passing of time, the survival probability was decreased in dKO mice. The survival probabilities of female and male dKO mice were significantly worse than that of wild-type controls, respectively (P<0.001,P<0.001;P<0.001,P<0.001). No significant difference was observed between the males and females of dKO mice. Conclusions Double knockout presenilin-1 and presenilin-2 genes may shorten the life span of mice, but there is no significant gender difference between the males and females of dKO mice.

dKO mice; Conditional knockout; Mice; Life span

四川省科技厅科技支撑计划(2012SZ0172)；四川省教育厅重点项目(16ZA0196)；西南医科大学-泸州市科技局联合资助项目(2015LZCYD-S06(6/11))；西南医科大学重点项目(2015-YJ002)；西南医科大学附属医院科研项目(15056，15087)。

唐红，女，副教授。E-mail:136810735@qq.com；唐晓琴为共同第一作者。

阮思蓓(1988-)，女，医师。 研究方向：临床及实验病理学。 E-mail: 294834533@qq,com；唐明希，男，博士，副教授，硕士研究生导师。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0006-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.002

2016-07-28