小檗碱对小鼠成骨细胞增殖和成骨活性的影响

李善昌，赵 刚，王飞飞，付雅楠

(佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002)



小檗碱对小鼠成骨细胞增殖和成骨活性的影响

李善昌，赵 刚，王飞飞，付雅楠

(佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002)

目的：研究小檗碱对小鼠成骨细胞增殖和成骨活性的影响。 方法：在中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心购买成骨细胞MC3T3-E1，进行培养，待培养一定数量后应用CCK8法检测出小檗碱对成骨细胞增殖的影响，应用ALP法检测出小檗碱对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响，应用茜素红法染色观察小檗碱对成骨细胞钙化结节形成的影响。结果：用CCK-8法检测出，小檗碱在1×10-5mol/L时成骨细胞增殖率最高，其他浓度略有增殖，但程度相对减少；ALP 活性测定，小檗碱在1×10-5mol/L时成骨细胞碱性磷酸酶最高，其他浓度略有升高，但程度相对减少；小檗碱在浓度为1×10-5mol/L培养28d时钙化结节形成最显著。结论：小檗碱对小鼠成骨细胞增殖和成骨活性均有促进作用且在1×10-5mol/L时促进作用最明显。

小檗碱;成骨细胞;增殖;成骨活性

成骨细胞是骨形成过程中十分重要的细胞，主要负责骨基质的矿化，分泌和合成[1]。成骨与破骨过程的动态平衡是维持骨量正常的关键[2～4]。成骨细胞不仅能够决定骨的形成，同时也可以调节破骨细胞对骨的吸收，它的增殖在很大程度上决定了最终形成的骨量。牙槽嵴顶下骨密度的变化要先于牙槽骨高度的变化，至少 30%的牙槽骨矿物含量丧失时才能在X线片上表现出高度的降低[5]。因此在临床诊断和治疗过程中，了解与认识成骨细胞在骨重建过程中的作用具有重要意义。

小檗碱(berberine)又名黄连素,是从毛茛科植物黄连根茎中提取的异喹啉生物碱,有抗炎、抗肿瘤、抗菌作用、降血糖和调血脂等作用[6,7]。近年来发现小檗碱对骨质疏松具有预防作用[8]。为了进一步探讨小檗碱抗骨质疏松作用机制,本实验采用细胞培养技术,观察小檗碱对体外培养的成骨细胞增殖、成骨活性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

小檗碱标准品购买于中国药品生物制品检定所，纯度≥98%，成骨细胞MC3T3-E1购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心、胎牛血清(Gibco公司)、青霉素链霉素溶液-双抗(HyClone海可隆公司)、0.25%胰蛋白酶消化液(HyClone海可隆公司)、PBS(碧云天生物技术研究所)、二甲基亚砜(Sigma公司)、Cell Counting Kit-8试剂盒(Boster博士德生物) 、ALP试剂盒(南京建成生物工程研究所)、茜素红(碧云天生物技术研究所) 。

1.2 主要仪器

电子天平(OHAUS,美国)、Olympus显微镜(日本Olympus显微镜)、酶标仪(TAKARA,日本)、CO2培养箱(美国ThermoForma公司)等。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

倒置相差显微镜下观察购买的 MC3T3-E1成骨细胞,在无菌操作台下，将原培养基吸去，加入3ML PBS溶液清洗2遍,加入0.25%胰酶1mL,于CO2培养箱中消化1min 后,在显微镜下观察细胞状态变化。当细胞收缩、变圆，大部分从培养瓶底脱落时,加入完全培养基2mL终止消化,反复吹打细胞使其成为均匀的单细胞悬液,移至15mL离心管,置于离心机中，1000rpm离心3min,吸去上清液,加入含10%胎牛血清、1%双抗的α-DMEM培养基2mL,轻轻多次吹打,使其均匀。接种至2个新培养瓶中,每个培养瓶再加入4mL完全培养基，置于 37℃、5%CO2培养箱中培养。每2天换液1次。

1.3.2 细胞传代

培养1～2d,待细胞铺满培养瓶80%～90%时,用PBS冲洗，胰蛋白酶消化,悬成 1×105个/mL的密度备用。

1.3.3 Cck8 法测定小檗碱对MC3T3-E1细胞的增殖影响

取3块96孔板，每块板都分为对照组和实验组,实验组分为A、B、C、D、E五个亚组，每组5个复孔，用0.25%的胰酶消化成骨细胞后将其调整为密度为1×105个/mL,各组均加入100μL的细胞悬液。置于CO2培养箱中,培养24h至细胞贴壁，为了保证每孔体积相同，对照组不加任何试剂，只加100μL完全培养基;实验组各加入浓度分别为1×10-4mol/L，1×10-5mol/L，1×10-6mol/L，1×10-7mol/L，1×10-8mol/L小檗碱100μL，置37℃温箱。细胞培养，并分别于1d，3d，5d分别取出一块96孔板，按Cck8测试盒说明书进行检测。用酶标仪测定450nm时每孔细胞OD值。以上实验重复3次，求出其平均值。

1.3.4 ALP活性测定

取3块96孔板,每块板都分为空白对照组，标准对照组和实验组,实验组分为A、B、C、D、E五个亚组，方法同Cck8相同，分别于1d、3d、7d取出按碱性磷酸酶ALP测试盒说明书进行检测。用酶标仪测定520nm时各孔吸光度OD值。按照试剂盒说明书计算出培养细胞中的ALP活力。

1.3.5 ME3T3-E1成骨细胞钙化结节染色

6孔板中每孔接种1×105/mL成骨细胞1mL，培养24h待细胞贴壁后，实验组分别加入不同浓度的小檗碱及含成骨诱导液的完全培养基1mL，对照组只加含成骨诱导液的完全培养基1mL，隔天换液,28d后将待测各孔培养液吸出，每孔加入2mL PBS清洗2遍，用茜素红法染色并拍照。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 Cck8法测定小檗碱对MC3T3-E1细胞增殖影响

结果表明：与对照组相比，1×10-8mol/L实验组在1d、3d均无统计学意义。1×10-7mol/L实验组和1×10-4mol/L实验组与对照组相比分别在1d、5d无统计学意义。其余实验组在各个时间段与对照组相比都有统计学意义。各实验组两两比较均有意义。说明各实验组在不同时间段对成骨细胞增值均有不同程度的促进作用，并在 1×10-5mol/L促进增殖效果最明显，见表1。

表1 小檗碱对小鼠成骨细胞增殖的影响

注：与对照组相比，无统计学意义(*P>0.05)。

2.2 ALP活性测定

结果表明：1×10-8mol/L实验组在1d时与对照组比较无统计学意义。 1×10-4mol/L实验组在7d时无统计学意义，说明高浓度的小檗碱在1d、3d时对成骨细胞ALP活性有促进作用，而在7d时则有抑制作用。其他浓度在各时间点均有促进作用，且随时间推移，作用效果越显著。其中 1×10-5mol/L在各个时间点上促进效果最明显。见表2。

表2 小檗碱对小鼠成骨细胞ALP活性的影响

注：与对照组相比，无统计学意义(*P>0.05)。

2.3 茜素红染色

结果表明：于28d对实验组和对照组的成骨细胞进行染色，1×10-5mol/L实验组与对照组相比钙化结节形成最显著。见图1和图2。

图1 1×10-5mol/L 实验组成骨细胞茜素红染色(×10)

图2 对照组成骨细胞茜素红染色(×10)

3 讨论

成骨细胞在骨代谢过程中起着重要的作用，促进成骨细胞增殖及分化成熟是防治骨质疏松症的主要方法之一，已有实验证明复合材料明显加速了骨修复进程,具有良好的成骨活性[9]。体外培养的成骨细胞也是进行新药开发和药效评估的重要模型[10～12]。在骨组织形成过程中，成骨细胞先合无钙盐沉积的类骨质，由成骨胶纤维和有机骨基质构成，内含唾液蛋白，类脂等。类骨质不断将成骨细胞包埋其中，使成骨细胞成为骨细胞，类骨质经钙盐沉积变成为骨组织。 近年来研究发现小檗碱具有通过抑制破骨细胞的形成分化来抑制骨吸收，提高骨小梁的厚度及减少骨量丢失的作用[13]。碱性磷酸酶是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，特异性高[14],是成骨细胞分化成熟的标志之一[15],也是很重要的评价骨形成的指标，是反应成骨细胞活动强弱的非常重要的标志。钙化结节是成骨细胞成骨活性的重要体现之一。Cck8法和Alp法均显示1×10-5mol/L的小檗碱有明显促进成骨细胞增殖和成骨活性的作用。不同浓度的小檗碱对成骨细胞起作用的时间点不同，说明此药物对细胞增值和成骨活性的促进作用具有时效性。茜素红染色显示1×10-5mol/L小檗碱28d时能明显促进钙化结节形成。本实验直接将小檗碱作用于成骨细胞，其作用机制需做进一步研究。

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The effects of berberine on the proliferation and osteogenic activity of osteoblasts in mice

LIShan-chang,ZHAOGang,WANGFei-fei，FUYa-nan

(Jiamusi Stomatological Hospital, Jiamusi 154002, China)

Objective: To study the effect of berberine on the proliferation and osteogenic activity of osteoblasts in mice. Methods: Osteoblasts MC3T3-E1, purchased in the Cell resource center, Shanghai institute of life science, Chinese Academy of Sciences, were needed to be cultivated a certain number. Berberine on bone cell proliferation was detected by using CCK8 method, and bone cell alkaline phosphatase activity was detected by using ALP method. The influence of bone cell calcification nodule formation was detected by using red method dyeing effect. Results: CCK-8 method was used to detect the proliferation rate of osteoblasts, and berberine in 1×10-5mol/L osteoblast proliferation rate is the highest, while other concentration was slightly proliferated, but the degree is relatively reduced. ALP activity determination of berberine in 1×10-5mol/L osteoblast alkaline phosphatase was the highest. The concentration of others slightly increased, but the degree was relatively reduced. Berberine cultivated in the concentration of 1×10-5mol/L 28 d was the most significant in calcified nodules form. Conclusion: Berberine can promote the proliferation and osteogenic activity of osteoblasts in mice and promote the effect when the concentration is 1×10-5mol/L.

berberine;osteoblast cells;proliferation;osteogenic activity

黑龙江省教育厅科研项目，编号：12521553。

李善昌( 1969～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，教授，硕士研究生导师。

王飞飞(1991～)女，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。E-mail:532103993@qq.com。

R285.5

A

1008-0104(2016)06-0024-03

2015-12-02)