MSC/rhBMP-2结合藻酸钙凝胶治疗激素性股骨头坏死的研究

吕 煜，季庆辉，张泽琦，满 婧，姚丽岩，王思懿

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)



MSC/rhBMP-2结合藻酸钙凝胶治疗激素性股骨头坏死的研究

吕 煜，季庆辉，张泽琦，满 婧，姚丽岩，王思懿

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的:探讨自体MSC与rhBMP-2结合藻酸钙凝胶治疗激素性股骨头坏死的疗效及其促进成骨和新生血管的作用。方法：将新西兰大白兔40只进行激素性股骨头坏死模型制备后,随机的方式分成A、B、C、D、E、F6组,A组：激素性股骨头坏死组；B组：单纯减压组；C组：减压后植入MSC；D组：减压后植入MSC及rhBMP-2；E组：减压后植入MSC及藻酸钠悬液及氯化钙溶液；F组：减压后植入MSC/rhBMP-2和藻酸钙凝胶在坏死股骨头内。术后第4周及第8周各组兔子行X线检查,然后处死兔子取股骨头行常规组织学染色进行评估。结果：在8周时，F组的标本股骨头坏死钻孔处有大量的成骨细胞和新生血管产生，经分析统计，F组与其他组比较骨陷窝阳性数和血管数目差异(P<0.05)具有统计学意义。结论：MSC/rhBMP-2和藻酸钠悬液及氯化钙溶液治疗激素性股骨头缺血性坏死，通过诱导MSC转化为成骨细胞,既修复骨还促进血管生成，有利于改善早期坏死股骨头血运行，MSC/rhBMP-2结合藻酸钙凝胶治疗激素性股骨头坏死有较好应用前景。

激素性股骨头坏死;骨髓间充质干细胞;自体移植;藻酸钙凝胶

糖皮质激素是引起股骨头缺血性坏死最常见原因, 患病率为3%～38%[1]。股骨头缺血性坏死 (osteonecrosis of the femoral head,ONFH)最终可产生髋关节骨性关节炎，关节间隙狭窄，股骨头塌陷变扁，甚至与髋臼黏连，致使人的髋关节疼痛和功能障碍，它是由各种原因导致股骨头缺血、骨坏死，进而股骨头塌陷，如果早期有一种有效的干预治疗，可防止产生髋关节致残，目前临床上没有完美治疗方法。本研究对兔激素性股骨头坏死模型进行在髓芯减压的基础上将骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)和(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)结合藻酸钙凝胶移植到减压区, 观察其疗效。

1 材料和方法

1.1 材料

新西兰大白兔40只(年龄4～5个月,体重2.5～3.0kg),6组动物分笼，同条件喂养。首先将10μg/kg脂多糖经兔的耳缘静脉注射,1d后肌肉注射20mg/kg的甲强龙,共3d(每天1次)，6周之后选出成功的模型[2]。最终除去死亡和失败的模型，还剩36只。将其分成A、B、C、D、E、F组,A组为试验对照组。

1.2 兔骨髓间充质干细胞分离培养

按pittenger方法[3]，取自新西兰兔自体，麻醉采用速眠新肌注射消毒髂骨，12号骨髓穿刺针穿刺抽取骨髓5mL吹打成细胞悬液，采用密度梯度离心法，置于percoll(密度1.073g/mL)液面上，2000r/min离心，20min后取中层云雾状细胞层，10cm细胞培养皿2×105云雾状细胞接种，加100mL/L胎牛血清培养液，置于37℃，50mL/L CO2培养箱中，5d后首次换液，冲去红细胞,可见多个成纤维细胞克隆贴壁长，用0.25%胰蛋白酶消化，培养孔1/2长满细胞,原孔传代2～3d，培养孔长满培细胞，细胞培养瓶按1×106/cm2密度移入。第3代细胞长满消化细胞，配成2×106/cm2悬液细胞，每个股骨头内含细胞悬液50μL，共10万个细胞,细胞培养箱中孵育4h备用。

1.3 藻酸钙凝胶的制备

将102mmol/LCaCl2溶液与1.2%藻酸钠溶液通过祸旋混合器横拌(1800r/min),快速充分混合20s。将混合溶液放置于圆柱形定制模具(直径10mm，高10mm)中塑型5 min。然后将该支架转移到含有15mLCaCl2溶液的培养皿中静置10min最后用稱酸缓冲液清洗两次即制备成水凝胶三维支架。pH值调为7.4,121℃高压蒸汽灭菌20min,4℃备用[4]。

1.4 实验方法

兔取俯卧位，40mg/kg硫贲妥钠做腹腔麻醉注射，备皮穿刺部位→消毒→铺巾。2号骨穿针X线下刺入股骨头中心。A组：激素性股骨头坏死组；B组：单纯减压组；C组：减压后植入MSC；D组：减压后植入MSC及rhBMP-2；E组：减压后植入MSC及藻酸钠悬液及氯化钙溶液；F组：减压后植入MSC/rhBMP-2和藻酸钙凝胶在坏死股骨头内。术后第4周及第8周各组兔子行X线检查,然后处死兔子取股骨头行常规组织学染色。手术后各组分笼饲养，5d连通续肌肉注射青霉素40万U/d。手术后4、8周采用X线检测结果，所有动物均采用耳缘静脉注射空气栓塞致死法处死取股骨头，股骨头劈为1/2组织学观察。

1.5 观察指标

1.5.1 MSC生长观察，A、B、C、D、E、F各组切片HE染色, 观察股骨头坏死区情况。在染色的切片中，观察血管数目时,依次任选5个20×40倍倍视野在软骨下区,计血管数目,求出平均值。高20×40倍镜观察骨陷窝，随机选5个视野, 计数1个视野内50个骨陷窝得出空缺骨陷窝百分率。

1.5.2 股骨头X线检查 待兔麻醉后仰卧于X线检查桌股骨头置于中心，检测股骨头情况。

1.6 统计学方法

采用SPSS18.0分析处理，A、B、C、D、E、F各组采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 MSC生长观察

MSC培养生长第5d时，观察MSC克隆集落贴培养瓶壁生长。消化传代2～4h后细胞贴壁生长，2～3d长满培养瓶底。传代2～7d以指数生长，倍增时间48h。见图1。

2.2 组织学观察

组织切片观察股骨头：A组：4周时观察软骨与细胞及骨髓出现坏死，空骨陷窝数量增加，骨小梁有不规则出现。8周时关节软骨面磨损与修复并存，骨吸收和软骨面塌陷。B组： 4周时股骨头组织切片标本缺损处， 出现成骨细胞稀少现象。 8周时仅

钻孔区少量形成骨髓组织并有少量毛细血管，钻孔区边缘形成少量新生骨小梁和类骨质。其余4组在4周时缺损处内有许多成骨细胞和新生血管形成，F组最多。F组8周标本缺损处有大量的成骨细胞，可见成熟骨小梁,并且排列有序,相互交织。

图1 原代MSC(20×40)

2.3 A、B、C、D、E、F各组空骨陷窝数和血管密度比较分析

手术后4、8周, 空骨陷窝数和血管密度测定数据运用SPSS18.0分析处理，A、B、C、D、E、F各组采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。F组与其他组比较骨陷窝阳性数和血管数目差异具有统计学意义(P<0.05)。各组术后4、8周空骨陷窝计数见表1；各组术后4、8周血管计数见表2。

表1 各组术后4、8周后空骨陷窝计数±s)

注：同一组在4周与8周之间相比*P<0.05；分别在4、8周时各组与F组相比△P<0.05。

表2 A、B、C、D、E、F各组术后4、8周后血管计数

注：同一组在4周与8周之间相比*P<0.05；分别在4、8周时各组与F组相比△P<0.05。

2.4 坏死股骨头X线检查

A组标本：4周时股骨头密度改变，骨小梁结构错乱；8周时股骨头出现软骨下囊性变。见图2。B组标本：手术后4周减压区仅钻孔边缘增高密度，减压区内无明显密度改变。C、D、E、F各组：手术后4周减压区密度低；手术后8周C组有稀疏骨小梁结构出现，D、E、F组有较密骨小梁结构出现，F组骨密度出现最高现象。见图3。

图2 8周后模型组

图3 8周后F组修复兔

3 讨论

股骨头坏死的发病机制尚不清楚，由复杂多因素导致股骨头缺血及骨细胞坏死病理过程。青壮年时期多见于股骨头早期坏死, 如果干预治疗，很短时间出现关节面塌陷而需要置换股骨头[5]。但是髋关节置换术后可用的寿命有限, 因此延长进行髋关节置换手术的时间非常关键，近年来，应用干细胞移植治疗早期股骨头坏死已经是目前一种可选的方法，成为了研究中的热点[6]。股骨头内高压在股骨头坏死发生发展中起到了重要作用，很长期髓芯减压术是股骨头缺血性坏死治疗常用方法。髓芯减压治疗主要采用改变坏死股骨头内高压微环境，从而增加了坏死区内的血液供应，是当前治疗早期股骨头坏死的方法之一[7]。在髓芯减压的基础之上将MSCs移植到减压处，为治疗坏死股骨头提供了种子细胞，从而为骨爬行替代和新生血管提供了基础条件[8]。BMP是TGF-β超家族成员之一,是应用最广泛的信号蛋白在骨组织工程中，在这个家族中BMP-2是最重要的成骨形成调控因子[9]。一些研究认为，在修复ONFH的手术中，加入BMP-2能有效提高打压植骨术疗效[10]。胡彤宇等[11]通过研究发现BMP-2能刺激新生血管在新生骨周围形成。藻酸钙能泌钙离子促进MSCs进一步分化为成骨的能力，并且具有三维立体多孔理想的结构[12],提供了良好的微环境为细胞在其内部生长、增殖和分泌基质[13]。本实验将自体MSC与rhBMP-2结合藻酸钙凝胶同时注入股骨头。通过X线检查 、组织学染色评价疗效。在8周时，F组的标本股骨头坏死钻孔处有大量的成骨细胞和新生血管产生，经分析统计，F组与其他组比较骨陷窝阳性数和血管数目差异具有统计学意义(P<0.05)。总之 , MSC/rhBMP-2结合藻酸钙凝胶治疗激素性股骨头坏死具有如下优点：①方法简单，②手术安全，③创伤相对较小，④疗效可靠。临床治疗股骨头坏死方面运用髓芯减压方法,rhBMP-2不但加速骨生长,而且促进新生血管形成，并且藻酸钙凝胶释放钙离子促进MSCs的成骨，从而可以提高MSC治疗早期股骨头坏死疗效 。

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1.黑龙江省大学生创新创业训练计划重点项目，编号：201510222013；2.佳木斯大学科学技术重点项目，编号：12Z1201508；3.佳木斯大学附属第一医院院级培育课题：编号：2014年。

吕煜(1992～)女，黑龙江鸡西人，在读本科生。

季庆辉(1983～)男，黑龙江黑河人，硕士，主治医师，讲师。E-mail:jqh19833@163.com。

R687.4

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1008-0104(2016)06-0031-03

2016-07-11)