抗氧化剂对胆固醇高温氧化抑制作用研究

徐贵华 刘东红 赵瑞香 陈健初 王 俊 叶兴乾

(河南科技学院食品学院1，新乡 453003)(浙江大学生物系统工程与食品科学学院2，杭州 310058)

抗氧化剂对胆固醇高温氧化抑制作用研究

徐贵华1，2刘东红2赵瑞香1陈健初2王 俊2叶兴乾2

(河南科技学院食品学院1，新乡 453003)(浙江大学生物系统工程与食品科学学院2，杭州 310058)

探讨了11种抗氧化剂对胆固醇在空气和猪油中高温氧化的抑制作用以及对猪油过氧化值的影响。使用气相色谱-质谱联用技术检测高温氧化前后胆固醇含量变化，同步检测5种主要高温氧化产物(7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、5,6β-环氧基胆固醇、5,6α-环氧基胆固醇、7-酮基胆固醇)。结果表明：多种抗氧化剂对胆固醇在空气中的高温氧化可以起到明显的抑制作用，以芦丁、槲皮素、绿原酸、咖啡酸效果最好。胆固醇在猪油中氧化程度较弱，11种抗氧化剂中只有咖啡酸表现出较好的抑制作用。过氧化值的对比研究发现：咖啡酸、橙皮素、柚皮素、维生素E、BHT均有一定的降低过氧化值作用，其中以咖啡酸效果最佳。不同抗氧化剂对空气中胆固醇高温氧化的抑制有很大不同，从而有助于筛选具有较强高温抗氧化能力的抗氧化剂。咖啡酸的高温抗氧化能力值得关注。

抗氧化剂 胆固醇 高温氧化 猪油 气相色谱

胆固醇广泛存在于动物源食品中，其在剧烈的加工条件下及不当贮藏时会发生复杂的氧化反应，生成一系列胆固醇氧化产物，如羟基胆固醇、环氧基胆固醇、酮基胆固醇等，研究证实，这些氧化产物对人体的危害比胆固醇更大[1]。对于油脂含量较高的食品，人们通常比较重视油脂的氧化酸败。针对这方面的研究指标有很多，如酸价、羰基价、丙二醛、过氧化值等。这些指标有助于从宏观上反映油脂的氧化酸败程度，但无法从微观角度详细描述油脂氧化情况。目前对油脂氧化酸败的研究已很多，但对其中胆固醇氧化反应研究较少，缺乏油脂中胆固醇氧化与氧化酸败关系的报导。国外对食品中胆固醇氧化方面的研究较多，试验对象通常是胆固醇含量较高的动物性油脂[2- 3]、肉制品[4]、乳制品[5]、水制品[6-7]、蛋制品[8-9]等，国内该领域报导还较少[10-11]。本研究检测了胆固醇氧化产物中含量较高的5种： 7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、5,6β-环氧基胆固醇、5,6α-环氧基胆固醇、7-酮基胆固醇。为了探讨抗氧化剂对油脂氧化酸败和胆固醇高温氧化的影响，选择了9种天然酚类物质，包括6种黄酮：芦丁、槲皮素(前者是后者的糖苷形式)、橙皮苷、橙皮素(前者是后者的糖苷形式)、柚皮苷、柚皮素(前者是后者的糖苷形式)；3种酚酸：咖啡酸、阿魏酸(前者是后者的酯化形式)、绿原酸；2种常用抗氧化剂，即维生素E(α-生育酚)和BHT(丁基化羟基甲苯)，研究胆固醇在空气和猪油中的高温氧化特性及5种抗氧化剂在抑制其高温氧化产物生成时的表现，并探讨猪油过氧化值变化。本研究有助于从微观上解释胆固醇高温氧化特性，对筛选天然油脂抗氧化剂有参考价值。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

胆固醇(cholesterol)、7α-羟基胆固醇(7α-hydroxycholesterol)、7β-羟基胆固醇(7β-hydroxycholesterol)、5,6β-环氧基胆固醇(5,6β-epoxycholesterol)、5,6α-环氧基胆固醇(5,6α-epoxycholesterol)、7-酮基胆固醇(7-ketocholesterol)、5α-胆甾醇(5α-cholestane)、三甲基硅烷基试剂(trimethylsilyl (TMS) reagent)、芦丁(rutin)、槲皮素(quercetin)、BHT、维生素E(Vitamin E, α-tocopherol)、绿原酸(chlorogenic acid)、咖啡酸(caffeic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、橙皮苷(hesperidin)、橙皮素(hesperitin)、柚皮苷(naringin)、柚皮素(naringinin)：美国Sigma公司;猪油:市售。其他试剂为分析纯。

1.2 抗氧化剂对空气中胆固醇高温氧化的影响

1.3 抗氧化剂对猪油中胆固醇高温氧化的影响

将猪油溶于正己烷，使其浓度为10%。再将胆固醇加入并充分溶解混匀，使胆固醇的浓度为0.1%(即猪油中胆固醇含量为1%)。取400L上述溶液于试管中，加入8g的抗氧化剂(事先用甲醇配制成100g/mL的溶液待用)，相当于猪油中抗氧化剂的加入量为200 mg/kg。先用氮气吹干有机溶剂，然后放入烘箱中于160 ℃下加热1 h。冷却至室温，加入80g的5α-胆甾醇作为内标，用2 mol/L的KOH乙醇溶液进行冷皂化并过夜，然后用正己烷对未皂化部分进行提取，再用氮气将正己烷吹干，加入TMS三甲基硅烷基试剂于60 ℃下进行衍生化反应60 min，反应结束后用氮气吹干，然后用正己烷溶解定容，过0.22m有机滤膜后，取1L进入GC-MS检测。

1.4 气质联用色谱条件

采用安捷伦7890A气质联用色谱仪对胆固醇及其氧化产物进行检测。色谱条件：弹性石英毛细管柱(SACTM-5, 30 m×0.25 mm, i.d.; Supelco, Inc., Bellefonte, PA, USA)，氦气流速为1.5 mL/min，柱温以30 ℃/min的速度从80 ℃升至270 ℃，然后保持22 min，进样口和检测器温度均保持在280 ℃。

1.5 过氧化值的测定

采用GB/T 5009.37—2003中的第2法比色法测定油脂氧化的过氧化值。过氧化值单位为mmol/kg。

1.6 定性和定量分析

胆固醇及其氧化产物的定性方法采用保留时间、标准品比对和质谱库检索方法。定量分析采用内标法，依据总离子流图峰面积进行计算。所有样品均作3次平行，测定结果以均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 抗氧化剂对空气中胆固醇高温氧化的影响

采用GC-MS检测分析了胆固醇及其5种主要氧化产物：7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、5,6β-环氧基胆固醇、5,6α-环氧基胆固醇、7-酮基胆固醇，结果如表1、表2所示。表1显示了11种抗氧化剂对胆固醇在空气中氧化的抑制作用，以未氧化胆固醇的量(越高抗氧化效果越好)与胆固醇氧化产物的量(越低抗氧化效果越好)来表示抗氧化效果。160 ℃下加热1 h，未氧化胆固醇剩余量为24.13%，胆固醇氧化产物(5种氧化产物合计值)为10.64%，5种胆固醇主要氧化产物中以7-酮基胆固醇含量最高。通过添加相当于2%胆固醇量的抗氧化剂，胆固醇的氧化受到不同程度的抑制。芦丁、槲皮素、绿原酸、咖啡酸效果最好，可以完全抑制胆固醇氧化产物的产生，同时胆固醇的量也基本保持不变。相比之下，工业中常用的抗氧化剂BHT几乎未起到抑制胆固醇氧化的作用。维生素E的效果与阿魏酸相当，但作用明显不如上述4种酚类物质。另外，橙皮素和柚皮素对胆固醇氧化有较弱的抑制作用，但它们的糖苷化形式(橙皮苷和柚皮苷)则完全不能抑制胆固醇的氧化。综合表1的结果，对11种抗氧化剂抑制胆固醇高温氧化作用的排序： 芦丁≈槲皮素≈绿原酸≈咖啡酸>阿魏酸≈维生素E>柚皮素≈橙皮素>柚皮苷≈橙皮苷≈BHT。

表1 抗氧化剂对空气中胆固醇高温氧化的抑制作用(%,160 ℃下加热1 h)

注：“-”表示未检测到或低于检测限，余同。

表2 抗氧化剂对猪油中胆固醇高温氧化的抑制作用(%,160 ℃下加热1 h)

通过研究抗氧化剂对胆固醇高温氧化的抑制作用，可以在一定程度上反映抗氧化剂的高温抗氧化能力，从而区别于常见的还原力、FRAP抗氧化能力、ORAC抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力等一系列在常温条件下测定抗氧化能力的方法。

2.2 抗氧化剂对猪油中胆固醇高温氧化的影响

胆固醇在猪油中的氧化特点及所选11种抗氧化剂在此条件下的表现情况如表2所示。在160 ℃下加热1 h，未氧化胆固醇剩余量为63.00%，胆固醇氧化产物(5种氧化产物合计值)为1.11%。与在空气中相比，胆固醇在猪油中氧化速度明显较慢，生成的胆固醇氧化产物亦较少[12]。相当于200 mg/kg猪油量的抗氧化剂添加量，未能起到类似空气中胆固醇氧化的抑制效果，说明这些抗氧化剂在猪油中的抗氧化活性不如空气中。11种抗氧化剂中只有咖啡酸对猪油中胆固醇的高温氧化起到显著的抑制效果，其他抗氧化剂抑制效果均不明显(包括对空气中胆固醇高温抗氧化效果良好的芦丁、槲皮素、绿原酸)。这表明胆固醇氧化与所在介质有很大关系，而抗氧化剂在不同介质条件下的作用效果差别也很大。研究认为猪油中取得的结果更接近于食品中胆固醇高温氧化的真实情况，因此，又对照研究了抗氧化剂对猪油过氧化值的影响。

2.3 抗氧化剂对猪油高温加热时过氧化值的影响

测定了160 ℃下加热1 h猪油的过氧化值，见图1。添加200 mg/kg的咖啡酸可以显著降低猪油过氧化值(从145.71 mmol/kg减至98.85 mmol/kg)，其他抗氧化剂中橙皮素(109.93 mmol/kg)、柚皮素(112.93 mmol/kg)、维生素E(115.24 mmol/kg)、BHT(109.03 mmol/kg)也取得较好的效果。芦丁和槲皮素对空气中胆固醇氧化抑制作用明显，但对猪油中过氧化值的降低作用较差，分别为139.21 mmol/kg(芦丁)、133.78 mmol/kg(槲皮素)。由此可见，猪油的过氧化值指标与胆固醇的氧化有很大不同，由过氧化值的单一指标不能反映出胆固醇的高温氧化情况。对猪油中胆固醇高温氧化的研究将有助于进一步阐明油脂氧化过程及程度。

图1 添加抗氧化剂对猪油过氧化值的作用(160 ℃下加热1 h)

3 结论

抗氧化剂对胆固醇的高温氧化可以起到抑制作用，尤其是当胆固醇在空气中氧化时。胆固醇在猪油中氧化程度相对较弱，所选择的11种抗氧化剂中仅有咖啡酸表现出较明显的胆固醇高温氧化抑制作用。过氧化值的对比研究表明，添加咖啡酸、橙皮素、柚皮素等可以有效降低猪油的过氧化值。单一的过氧化值指标不能反映胆固醇高温氧化情况。不同种类的抗氧化剂对胆固醇高温氧化的抑制有很大不同，从而有助于筛选高温抗氧化能力较强的抗氧化剂，咖啡酸的高温抗氧化能力值得关注。

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Inhibition Effects of Antioxidants on the Thermo-Oxidation of Cholesterol

Xu Guihua1, 2Liu Donghong1Zhao Ruixiang1Chen Jianchu2Wang Jun2Ye Xingqian2

(Department of Food Science, Henan Institute of Science and Technology1, Xinxiang 453003)(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University2, Hangzhou 310058)

Inhibition effects of 11 antioxidants on the thermo-oxidation of cholesterol in air and lard have been evaluated in the study, as well as their effect on the peroxides value of lard. Cholesterol and 5 major cholesterol oxidation products: 7α-hydroxycholesterol, 7β-hydroxycholesterol, 5,6β-epoxycholesterol, 5,6α-epoxycholesterol, and 7-ketocholesterol have been detected by GC-MS. The results showed that several antioxidants were effective in inhibition of thermo-oxidation of cholesterol in air; rutin, quercetin, chlorogenic, caffeic had achieved the favorable effects. Cholesterol was less oxidized in lard than in air; only caffeic had a satisfied perfoemance in inhibiting cholesterol oxidation. According to the results of peroxide value experiment, caffeic, hesperitin, naringinin, VE, and BHT could decrease the peroxide value effectively, among which caffeic was the best. Inhibition effects of different antioxidants on the thermo-oxidation of cholesterol in air varied greatly, which could be applied to screen the antioxidants with high thermo-antioxidation capacity. The thermo-antioxidation capacity of caffeic deserved more attention.

antioxidants, cholesterol, thermo-oxidation, lard, gas chromatography

TS22

A

1003-0174(2016)04-0100-04

国家自然科学基金青年基金(31201304),中国博士后科学基金(2013M541787),浙江省博士后择优资助(BSH1301025),河南省高校科技创新团队支持计划(13IRTSTHN006)

2014-08-01

徐贵华，男，1977年出生，副教授，食品氧化与抗氧化

叶兴乾，男，1962年出生，教授，食品科学