云南省傣族、汉族人群乙型肝炎病毒感染与IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168G/C的关联性研究*

李婷婷， 张亚龙， 高建梅， 贺军栋1, ， 严新民△

(1昆明理工大学医学院，云南 昆明 650504；2云南省第一人民医院，云南省临床基础医学研究所，云南省出生缺陷与遗传病研究重点实验室，云南 昆明 650032)



云南省傣族、汉族人群乙型肝炎病毒感染与IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168G/C的关联性研究*

李婷婷1, 2▲， 张亚龙1, 2▲， 高建梅2， 贺军栋1, 2， 严新民2△

(1昆明理工大学医学院，云南 昆明 650504；2云南省第一人民医院，云南省临床基础医学研究所，云南省出生缺陷与遗传病研究重点实验室，云南 昆明 650032)

目的： 探讨云南省西双版纳地区傣族和汉族人群IL-6 -572C/G 和I型干扰素受体1(interferon alpha receptor 1，IFNAR1) -168G/C位点单核苷酸多态性与乙型肝炎病毒(HBV)感染后疾病转归的关联性。方法:采集西双版纳州傣族、汉族人群血液样本共600份，其中每个民族包括健康对照组100名、HBV感染患者200名(含100名自限性恢复患者和100名慢性乙肝患者)，运用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)和DNA测序技术对IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168G/C位点进行基因分型。结果:傣族人群中，-572C/G位点基因型多态性与HBV感染后转归的关联性并无统计学显著性。C、G等位基因型在HBV感染组、正常对照组之间和慢性乙肝组、自限恢复组之间差异无统计学显著性。但是在G显性模式(GG+CG/CC)下，GG+CG基因型为HBV感染者发展成为慢性乙型肝炎患者的保护因素(P<0.05)。汉族人群中，-572C/G位点基因型和等位基因分布频率在各组比较中无统计学显著性，并且在G显性模式和G隐性模式比较中也无统计学显著性。在上述4种比较中，IFNAR1 -168G/C位点在汉族和傣族样本中的差异均无统计学显著性 。结论:IL-6 -572C/G位点GG+CG基因型可能是傣族人群中HBV感染者发展成为慢性乙型肝炎的保护因素，而IFNAR1 -168G/C多态性与HBV感染后转归在傣、汉两族中并无显著性关联。

IL-6； 干扰素α受体1；基因多态性； 乙型肝炎病毒

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种常见的流行性感染病毒，在中国人群中感染率约占10%，因此对HBV的研究是一个亟需深入探索的课题。人体内与免疫相关的细胞因子位点上多态性的差异会影响其产量的高低，使宿主对HBV的免疫清除和杀伤效果差别较大，继而导致个体转归的差异[1]。白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)位于染色体7p21处，由5个外显子和4个内显子及1个接近启动子区域的序列组成[2]，是一种多功能性的免疫因子，在调控细胞的增殖和分化过程中扮演重要的作用。此外IL-6作为诊断肝癌的分子标记之一，而通常常见的肝癌发生是由于HBV感染的继续恶化而转归所致[3]。IL-6基因多态性会影响IL-6 mRNA的表达，导致宿主体内IL-6产量的不同，继而对HBV病毒的清除产生差别。干扰素α受体1(interferon alpha receptor 1，IFNAR1)是定位于21号染色体上的干扰素α受体的亚单位，其产物能特异性地与干扰素α结合[4-5]，从而使体内产生抗病毒蛋白，抑制乙肝病毒的复制。本文挑选的这2个细胞因子与机体免疫关联很大，其产物能有助于对乙肝病毒的清除，影响患者疾病的转归。我们选取的是西双版纳地区傣族和汉族人群作为研究对象，运用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技术和测序验证对IL-6-572C/G、IFNAR1-168G/C位点进行检测，并从流行遗传病学的角度探讨基因结构与HBV感染转归的关系。

材 料 和 方 法

1 研究对象

在知情同意的原则下，收集西双版纳州医院汉族和傣族住院及门诊乙肝感染患者和健康对照血样各300份，其中汉族和傣族患者血样各200份(自限性恢复组与慢性乙肝组各100人)，汉族和傣族健康对照组各100份。收集的血样已确保3代以内无族外通婚，并且诊断标准参照2015年中华医学会感染病学会及中华医学会肝病学会修订的《中国慢乙肝防治指南》分为正常对照组和乙肝病毒感染组，其中乙肝病毒感染组又可以根据病情的转归情况分为自限性恢复组和慢性乙型肝炎组，各组无其他疾病交叉感染记录，研究对象的年龄、性别及肝功能指标分布见表1。

表1 研究对象年龄、性别及肝功能指标分布

TP other: TP<60 g/L and TP>80g/L; GLO other: GLO<20 g/L and GLO>35 g/L; ALT unit: U/L; AST unit：U/L.

2 方法

2.1 引物的设计与合成 用Gene Tool软件设计引物并交与上海捷锐公司合成，引物序列见表2。

表2 SNP位点的PCR引物序列及反应条件

2.2 IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168C/G位点多态性分析 采用Sangon柱式基因组抽提试剂盒提取基因组DNA作为模版进行PCR扩增，体系为TaKaRa 2×Mix混合液12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL， DNA 1 μL，补足ddH2O 10.5 μL。反应完成后分别用的BsrB I和DdeI 37 ℃水浴酶切2 h处理。酶切体系为：9 μL ddH2O， TaKaRa 10×Smart Buffer 1.5 μL，BsrB I (DdeI) 0.5 μL， PCR DNA 4 μL。随后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳仪设定为120 V，25 min，胶浓度为1.5%，于凝胶成像仪观察结果，随机选取10%的样本，采用ABI 3130测序仪进行DNA测序验证酶切结果。

3 统计学处理

结 果

1 PCR-RFLP结果

IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C2个位点的3种基因型均有检出，见图1、2。

Figure 1.The cleavage map for the IL-6-572C/G site of the samples.M:marker.

图1 样本IL-6 -572C/G位点酶切图

Figure 2.The cleavage map for the IFNAR1-168G/C site of the samples.M:marker.

图2 样本IFNAR1-168G/C位点酶切图

2 测序验证结果

IL-6 -572C/G位点多态性测序结果为GG/CG/CC(图3)；IFNAR1-168G/C位点多态性测序结果为GG/GC/CC(图4)。

Figure 3.The sequencing results for IL-6 -572C/G site. A: GG; B: CG; C: CC.

图3 IL6-572C/G位点测序结果

Figure 4.The sequencing results for IFNAR1-168G/C site. A: GG; B: GC; C: CC

图4 IFNAR1 -168G/C位点测序结果

3 基因多态性分析结果

经Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，样本中这2个位点基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，样本具备代表性。本研究分为基因型频率、等位基因分布频率、隐性基因的显性模式和隐性模式这4种分析方式在正常对照组、HBV感染组及慢性乙型肝炎组、自限性恢复组间进行比较，探寻差异是否具有统计学显著性。由表3得知，傣族人群中，-572C/G位点基因型多态性与HBV感染后转归的关联性并无统计学显著性。C、G等位基因型在正常对照组、HBV感染组及慢性乙肝组、自限性恢复组间差异无统计学显著性(表4)。在G显性模式(GG+CG/CC)下，基因型GG+CG为傣族HBV感染者发展成为慢性乙肝的保护因素(P<0.05)，见表5。汉族人群中，-572C/G位点基因型、等位基因分布频率在各组比较中差异无统计学显著性，并且在G显性模式和G隐性模式比较中差异也无统计学显著性。在上述4种比较中，IFNAR1-168G/C位点在汉族和傣族样本中差异均无统计学显著性。综上得出， GG+CG基因型为保护性因素，会降低傣族人群HBV感染后发展成为慢性乙型肝炎的风险，GG+CG基因型可能是傣族HBV感染人群发展成为慢性乙肝的保护性因素。

表3 傣族和汉族人群中IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C位点基因型和等位基因分布频率

Group A: healthy control group; Group B: HBV infection group; Group C: spontaneous recovery group; Group D: chronic hepatitis B group.

表4 傣族和汉族人群中IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168G/C位点等位基因分布频率的比较

Group A: healthy control group; Group B: HBV infection group; Group C: spontaneous recovery group; Group D: chronic hepatitis B group.

表5 傣族和汉族人群中IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C位点的非条件logistic回归模型分析

讨 论

目前，单核苷酸多态性与HBV感染后转归的研究受到重视，相关的细胞因子多态性与HBV感染转归的研究基本已经涵盖了已知的多数与免疫相关的细胞因子，如IL-6[3]、IL-10[6]、IL-28B[7]、TNF-α[8]、TGF-β[9]等。HBV进入机体受到T淋巴系统介导的对乙肝病毒的清除作用。在急性感染者中，T细胞比较活跃，能够迅速清除机体内的HBV病毒；而在慢性感染者中，T细胞所产生的抗体反应较弱，对病毒的清除作用有限，故而使病人持续感染而导致肝损害。此外，乙肝病毒还受到机体免疫系统所产生的一系列免疫蛋白的杀伤效应，而其产量的高低受到启动子区域特定位点的调控，因而对于该区域多态性的研究也是学者研究的重点。

HBV感染后转归的差异与人群有关，我们选取的研究对象是处于云南地区西双版纳傣族自治州医院的样本，由于地处边疆、交通不便，傣族与其他民族语言、饮食和宗教信仰的差异，很少与其他民族通婚，形成了相对的种族隔离，因此可以作为一个很好的样本来与汉族进行基因多态性与HBV感染差异性的研究。IL-6-572C/G基因多态性与HBV感染后转归的关联在不同民族和地域的人群中差别较大，Lu等[10]以自限性恢复人群和慢性乙肝人群为样本，得出-572C/G中GG基因型和G等位基因有助于HBV病毒的清除；而Tang等[11]研究得出，-572C/G多态性位点与慢性乙肝疾病的感染并无显著的联系。本文研究得出，在西双版纳州的傣族人群中，在基因型和等位基因分布上，-572C/G位点的多态性与HBV感染后转归的关联并无统计学显著性。在G显性模式(GG+CG/CC)下，自限性恢复组和慢性乙肝组之间的差异有统计学显著性，GG+CG基因型人群中慢性乙型肝炎发病风险显著低于CC基因型人群，研究结果与Lu等[10]相同。

IFNAR1 -168G/C多态性在4号外显子区域会发生Val(GTT)→Leu(CTT)转变，继而影响雌二醇羧化酶的活性[12]，雌二醇能抑制慢性HBV患者向原发性肝癌的转归，表现出雌二醇能抑制HBV的进一步发展[13]。Song等[14]在正常对照组、HBV感染组中(无症状感染组、急性肝炎组、慢性肝炎组、肝硬化组和肝癌组)比较得出显著性差异，正常组中会有较高频率的GTT基因型和较低的ALT浓度。但是我们研究得出，IFNAR1-168G/C突变在各对照组中并无显著性差异，这可能与我们选取的人种遗传背景的差异相关。本文研究结果显示，IFNAR1-168G/C在傣族和汉族人群中，等位基因频率分布、基因型频率和C显性模式和C隐性模式并无显著性差异。

综上所述，通过对IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C位点与傣、汉两民族人群HBV感染后转归的研究发现，虽然在基因型和等位基因分布频率上，IL-6-572C/G与傣族人群HBV感染后转归并无显著性关联，但是在G显性模式分布中表明IL-6-572C/G突变中GG+CG基因型会减少傣族人群中HBV感染者发展成为慢性肝炎的风险，是一个保护因素；而IFNAR1-168G/C位点在傣族和汉族人群中在各组比较中分布频率并无显著性差异。临床应用方面，通过采集长期注射恩替卡韦等核苷类药物的HBV感染人群的血液，根据患者病情发展来验证携带IL-6-C/G位点GG+CG基因型的患者是否有助于其康复，进而预测所使用药物的治疗情况，并希望能够为患者提供及时的防治措施[15]，这也是我们工作的下一步目标。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Association between IL-6 -572C/G as well as IFNAR1 -168G/C and hepatitis B virus infection in populations of Dai and Han ethnicities in Yunnan Province

LI Ting-ting1, 2, ZHANG Ya-long1, 2, GAO Jian-mei2, HE Jun-dong1, 2, YAN Xin-min2

(1CollegeofMedicine,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650504,China;2YunnanInstituteofBasicMedicalSciences,ProvincialKeyLaboratoryforBirthDefectsandGeneticDiseases,TheFirstPeople’sHospitalofYunnanProvince,Kunming650032,China.E-mail:yxmin08@163.com)

AIM: To explore the association between IL-6 -572C/G (rs1800796) as well as interferon alpha receptor 1 (IFNAR1) -168G/C (rs2257167) and prognosis after hepatitis B virus (HBV) infection in populations of Dai and Han ethnicities in Yunnan Province. METHODS: The blood samples were collected from Dai people and Han people, each nation including 100 healthy controls and 200 infected individuals (100 spontaneous recovery individuals and 100 chronic patients). Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and DNA sequencing were used to identify the gene type. RESULTS: In Dai people, no significant difference was found between genetic polymorphism of -572C/G and prognosis after HBV infection. The differences of C and G alleles between spontaneous recovery group and chronic hepatitis B group, and healthy controls and HBV infection group were not statistically significant. Meanwhile, GG and CG genotypes were a vital protective factor for the person who developed into a chronic heptatitis B patient under the G allele dominance mode (GG+CG/CC) (P<0.05). In Han people, no statistically significance for IL-6 -572C/G genotype and allele distribution in each group comparisons had been found, as well as the C allele recessive mode and C allele dominance mode. For the above 4 indicators, no statistically significant difference of IFNAR1 -168C/G in Dai and Han people had been found. CONCLUSION: The GG+CG genotype of IL-6 -572C/G may be a protective factor for the HBV-infected Dai people to develop into chronic hepatitis B patients. However, there is no significant association between the IFNAR1 -168G/C polymorphism and prognosis after HBV infection in the 2 ethnicities.

IL-6; Interferon alpha receptor 1; Genetic polymorphism; Hepatitis B virus

1000- 4718(2016)11- 2056- 06

2016- 06- 15

2016- 09- 01

国家自然科学基金资助项目(No. 81360398)；云南省卫生科技计划(No. 2014N269)；云南省教育厅科学研究基金项目(No. 2015J021);云南省科技计划(No. 2013FB200)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.023

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0871-63638454； E-mail: yxmin08@163.com

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