川芎嗪联合骨髓间充质干细胞移植抑制脑缺血大鼠神经细胞凋亡*

丁文倩, 李 琳， 储利胜△， 任翠翠， 方 燕， 杨 琰

(浙江中医药大学 1药学院， 2基础医学院， 浙江 杭州 310053)



川芎嗪联合骨髓间充质干细胞移植抑制脑缺血大鼠神经细胞凋亡*

丁文倩1, 李 琳2， 储利胜2△， 任翠翠1， 方 燕2， 杨 琰2

(浙江中医药大学1药学院，2基础医学院， 浙江 杭州 310053)

目的： 研究川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)联合骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)对脑缺血大鼠神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响。方法:采用全骨髓贴壁法体外培养BMSCs，传代至第3代用于尾静脉移植。采用线栓法诱导大鼠右侧大脑中动脉阻塞模型，除假手术组外，大鼠随机分为模型组、BMSCs(1×109/L)组、川芎嗪(40 mg/kg)组和联合(川芎嗪+BMSCs)组，每组12只。缺血后第1、7和14天采用改良的神经损伤严重程度评分(modified neurological severity scoring，mNSS)进行神经功能评价。缺血后第14 天，甲苯胺蓝染色检测脑梗死体积，HE染色观察脑组织病理学变化，采用原位末端标记(TUNEL)法观察神经细胞凋亡数，采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测Bax和Bcl-2的mRNA及蛋白表达。结果:与BMSCs组和川芎嗪组比较，联合组mNSS评分显著减少(P<0.01)，梗死体积显著减少(P<0.01)，缺血引起的脑缺血周边区病理性损伤明显减轻，TUNEL阳性细胞数显著减少(P<0.01)，Bcl-2的mRNA及蛋白表达显著增加，Bax的mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:川芎嗪联合BMSCs移植能显著促进脑缺血后大鼠的功能恢复，减少梗死体积，减轻脑组织缺血性损伤，抑制神经细胞凋亡，机制可能与调控Bcl-2和Bax的表达有关。

川芎嗪； 骨髓间充质干细胞； 脑缺血； 细胞凋亡

脑缺血是导致成年人死亡和残疾的主要原因。目前临床上急性期除了采用组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，tPA)溶栓治疗外，尚缺乏其它有效的治疗方法。但tPA存在治疗时间窗窄(<4.5 h)和出血的风险，严重限制其临床的应用[1]。近年来研究发现，干细胞移植治疗脑缺血有很好的应用潜能[2]。其中，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有取材方便、易扩增、低免疫原性和无伦理学争议等优点，被认为是组织工程的种子细胞。大量动物实验和临床研究表明，BMSCs移植不仅能促进脑缺血后神经功能恢复，而且是安全的[3]。

脑缺血发病机制非常复杂，其中缺血周边区神经细胞凋亡是其发病的主要机制之一[4]。BMSCs移植不仅能促进脑缺血后神经修复，还能抑制缺血周边区神经细胞凋亡[5]。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中药川芎的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用，已被临床广泛应用于缺血性脑血管病的治疗[6]。最近文献报道，采用中药或有效成分联合BMSCs治疗脑缺血具有更好的疗效[7]，但目前尚缺乏川芎嗪联合BMSCs移植治疗脑缺血的报道。因此，本研究首先观察川芎嗪联合BMSCs移植对脑缺血大鼠的治疗作用，然后从神经细胞凋亡的角度探讨其作用机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠，3周龄体重约80～100 g，3～4月龄体重250～300 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号为SCK(沪)2013-0016，浙江中医药大学实验动物中心饲养，许可证号为SYXK(浙)2013-0184。室温(22±1)℃，相对湿度40%～60%，12 h/12 h明暗循环，自由饮食进水。

2 药物与主要试剂

川芎嗪(阿拉丁试剂有限公司)；DMEM/F12培养基(杭州吉诺生物医药技术有限公司)；优级胎牛血清(Gibco)；鼠源单克隆抗体β-actin(Santa Cruz)；兔源Bcl-2和Bax多克隆抗体(CST)；山羊抗鼠II抗IgG、山羊抗兔II抗IgG和组织总蛋白提取试剂(Thermo)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Roche);BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；TRIzol试剂盒和逆转录试剂盒(TaKaRa)；PVDF膜(Millipore)。所用引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，见表1。

表1 引物序列

3 主要仪器

CO2恒温培养箱(SANYO)；冰冻切片机和正置荧光显微镜(Leica)；紫外可见分光光度计(Beckman)；电泳槽、转印槽、凝胶成像系统和实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad)。

4 主要方法

4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养 取3周龄SD雄性大鼠，颈椎脱臼法处死后迅速浸泡在75%乙醇中15 min，无菌条件下取出两侧后肢股骨和胫骨，除去骨干表面肌肉韧带等组织，剪去两侧干骺端，用5 mL注射器吸取4 ℃预冷的DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，用5 mL含10% 胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于25 cm2的培养瓶，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内培养，48 h后首次更换培养基，待细胞生长至85%～90%时用0.05%胰酶和0.02% EDTA消化收集细胞，按1∶2比例传代培养，待传代至第3代时进行实验。4.2 大鼠局灶性脑缺血模型的制备 取3～4月龄SD雄性大鼠，术前禁食12 h(不禁水)，参照Longa等[8]建立大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。大鼠用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎并游离颈外动脉主干，在颈外动脉剪一小切口, 将头端烧圆的3-0单股尼龙线从切口轻轻插入颈内动脉，当尼龙线插入距颈总动脉分叉约18～20 mm处有轻微阻力时，保持尼龙线位置。缺血90 min后将尼龙线拔出再灌注。假手术组，尼龙线只插入5 mm左右。术中光照维持大鼠肛温在37 ℃左右，术后将大鼠置于恒温箱中直至苏醒。

4.3 动物分组及BMSCs移植 大鼠造模后24 h，除假手术组外，随机分为模型组、BMSCs组、川芎嗪(40 mg/kg)组和联合(川芎嗪+BMSCs)组。川芎嗪组和联合组在缺血后2 h腹腔注射川芎嗪(40 mg/kg)，每天1次，连续14 d。BMSCs组和联合组于缺血后24 h经尾静脉注射1 mL BMSCs(1×109/L)，其它组经尾静脉注射1 mL PBS，每组12只。

4.4 改良的神经损伤严重程度评分(modified neurological severity scoring，mNSS) 参照文献[9]方法，在脑缺血后第1 、7 和14 天检测。包括一系列的运动、感觉、平衡和反射试验。神经功能评分的范围为0～18分(正常为0分，最严重为18分)。

4.5 脑组织冰冻切片的制备 大鼠脑缺血后第14天行为学评价结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，然后用4℃预冷的0.9%生理盐水快速进行心脏灌注，再经4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，4%多聚甲醛于4℃固定过夜，然后用30%蔗糖溶液脱水。从额极起将大鼠大脑切成6片冠状切片，每片厚2 mm，然后分别作10 μm和20 μm的切片。

4.6 脑梗死体积的检测 大鼠脑缺血后第14 天行为学评价结束后，20 μm的脑组织冰冻切片用1%甲苯胺蓝染色。脑组织片拍摄图像，用ImageJ软件计算脑片梗死区域面积，将每一脑片的缺血面积乘以厚度(2 mm)，再将各脑片数值相加，得到全脑梗死灶体积的近似值。

4.7 脑组织的病理学观察 大鼠脑缺血后第14 天，10 μm的脑组织冰冻切片进行HE染色，冰冻切片先用甲醇固定，苏木精染色5 min，1%的盐酸乙醇分化数秒，水洗返蓝，伊红染色1 min，各步骤之间水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察皮层和纹状体缺血周边区组织形态。

4.8 TUNEL法检测细胞凋亡 大鼠脑缺血后第14 天，10 μm的脑组织冰冻切片，经4%多聚甲醛固定30 min后，0.1%柠檬酸钠-0.1% Triton X-100冰上孵育2 min，3% H2O2-甲醇液孵育10 min，20 mg/L不含DNase I的蛋白酶K于37 ℃孵育20 min，TUNEL反应液37 ℃孵育60 min，封片，荧光显微镜下观察。

4.9 实时荧光定量PCR检测Bcl-2和Bax的mRNA表达 大鼠脑缺血后第14 天，取缺血周边区脑组织，按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，逆转录成cDNA，qPCR反应总体积10 μL：上游和下游引物各0.2 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。反应条件为95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共40个循环；72 ℃ 5 min；60 ℃ 30 s，共71个循环。结果采用2-ΔΔCt分析相对表达量。4.10 Western blot法检测Bcl-2和Bax的蛋白表达 大鼠脑缺血后第14 天，取100 mg缺血周边区脑组织，按照总蛋白提取试剂盒方法提取总蛋白，BCA法测定总蛋白含量，取蛋白样品进行凝胶电泳，转膜，封闭，加入I抗(兔抗Bax和Bcl-2多克隆抗体1∶1 000，鼠抗β-actin单克隆抗体1∶1 500)孵育，静置过夜，洗涤后加入II抗(山羊抗鼠II抗IgG 1∶5 000，山羊抗兔II抗IgG 1∶5 000)，室温孵育1 h，充分洗涤，置于ECL发光剂中，显影，定影，凝胶图像处理，采用Bandscan 5.0软件分析条带的吸光度值。

5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，行为学评分采用非参数Mann-WhitneyU检验，其余均采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行比较，组间均数两两比较采用 Student-Newman-Keuls法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 川芎嗪联合BMSCs移植对脑缺血大鼠神经功能的影响

脑缺血后第1 天，除假手术组外的各组大鼠都表现出严重的神经功能缺损。缺血后第7 天，与模型组比较，BMSCs组和联合组mNSS评分显著降低(P<0.01)，但川芎嗪组差异不显著；缺血后第14 天，与模型组比较，BMSCs组、川芎嗪组和联合组mNSS评分显著降低(P<0.01)；与BMSCs组和川芎嗪组比较，缺血后第7 天和14 天，联合组mNSS评分显著降低(P<0.01)，见图1。

Figure 1.The effect of TMP combined with BMSCs on the levels of mNSS in the rats with cerebral ischemia. Mean±SD.n=12.**P<0.01vsmodel;##P<0.01vsTMP+BMSCs.

图1 川芎嗪联合BMSCs对脑缺血大鼠mNSS评分的影响

2 川芎嗪联合BMSCs移植对脑缺血大鼠梗死体积的影响

脑缺血后第14 天，除假手术组外的各组大鼠脑组织均有梗死。与模型组比较，BMSCs组、川芎嗪组和联合组大鼠大脑梗死体积都显著减少(P<0.01)。与BMSCs组和川芎嗪组比较，联合组大鼠大脑梗死体积显著减少(P<0.05)，见图2。

3 川芎嗪联合BMSCs移植对脑缺血大鼠脑组织病理学的影响

脑缺血后第14 天，假手术组神经细胞核仁大，胞质丰富；模型组大脑皮层和纹状体缺血周边区神经细胞稀疏，核固缩，核仁变小；与模型组比较，BMSCs、川芎嗪和联合组均能减轻神经细胞损伤程度，其中联合组效果最好，见图3。

4 川芎嗪联合BMSCs移植对大鼠脑缺血周边区神经细胞凋亡的影响

脑缺血后第14 天，与模型组比较，BMSCs组、川芎嗪组和联合组TUNEL阳性细胞显著减少(P<0.01)；与BMSCs组和川芎嗪组比较，联合组TUNEL阳性细胞显著减少(P<0.01)，见图4。

5 川芎嗪联合BMSCs移植对Bcl-2和Bax mRNA表达的影响

脑缺血后第14 天，与模型组比较，BMSCs组和联合组Bcl-2的mRNA表达显著增加，Bax的mRNA表达显著降低(P<0.01)，川芎嗪组Bax的mRNA表达显著降低(P<0.01)，但Bcl-2的mRNA表达差异无统计学显著性；与BMSCs组和川芎嗪组比较，联合组Bcl-2的mRNA表达显著增加，Bax的mRNA表达显著降低(P<0.01)，见表2。

Figure 2. The effect of TMP combined with BMSCs on the infarct volume of brain in the rats with cerebral ischemia. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsmodel;#P<0.05vsTMP+BMSCs.

图2 川芎嗪联合BMSCs对脑缺血大鼠脑梗死体积的影响

Figure 3. The effect of TMP combined with BMSCs on the pathological changes of brain in the rats with cerebral ischemia (HE staining, ×400).

图3 川芎嗪联合BMSCs移植对脑缺血大鼠脑组织病理学的影响

6 川芎嗪联合BMSCs移植对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

缺血后第14 天，与模型组比较，BMSCs组、川芎嗪组和联合组Bcl-2蛋白表达显著增加，Bax蛋白表达显著降低(P<0.01)；与BMSCs组和川芎嗪组比较，联合组Bcl-2蛋白表达显著增加，Bax蛋白表达显著降低(P<0.01)，见图5、表3。

讨 论

脑缺血引起神经细胞死亡包括坏死和凋亡两种形式，缺血核心区内神经元迅速缺血坏死，而缺血周边区神经细胞主要表现为凋亡，经历数小时至数天，抑制神经细胞凋亡有助于促进神经功能恢复[10]。本研究发现，川芎嗪联合BMSCs移植显著改善脑缺血后神经功能，抑制缺血周边区神经细胞凋亡，上调Bcl-2表达，抑制Bax表达。

Figure 4. The effect of TMP combined with BMSCs on the neuronal apoptosis (TUNEL staining, ×400). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsmodel;##P<0.01vsTMP+BMSCs.

图4 川芎嗪联合BMSCs对神经细胞凋亡的影响

表2 川芎嗪联合BMSCs对脑缺血大鼠Bcl-2和Bax mRNA表达的影响

Table 2. The effect of TMP combined with BMSCs on the mRNA expression of Bcl-2 and Bax in the rats with cerebral ischemia (Mean±SD.n=5)

**P<0.01 vs model; ##P<0.01 vs TMP+BMSCs.

尽管国内外研究证明了BMSCs移植治疗脑缺血的安全性和有效性[3, 11]，但还有很多问题亟待解决，特别是BMSCs向缺血损伤区迁移率和植入后存活率低是限制其疗效的主要原因[12]。近年来文献报道，采用药物联合BMSCs移植可促进BMSCs向缺血损伤区迁移和存活，从而显著提高BMSCs对脑缺血的治疗效果[13]。最近国内研究报道，采用中药或有效成分联合BMSCs移植能显著提高脑缺血的治疗效果[7]，如补阳还五汤和人参皂苷Rg1联合BMSCs移植治疗脑缺血均有显著效果[14-15]。川芎是传统的活血化瘀中药，也是中医治疗缺血性脑血管病的常用中药。川芎嗪是川芎的主要有效成分，具有扩血管、抗炎、抗氧化和抗凋亡等多种药理作用[6]。本研究发现，与川芎嗪和BMSCs比较，两者联合治疗显著促进脑缺血后神经功能恢复，减少梗死体积，改善脑组织病理性损伤，这为川芎嗪联合BMSCs治疗缺血性脑血管病提供了实验依据。

Figure 5.The effect of TMP combined with BMSCs on Bcl-2 and Bax protein expression determined by Western blot.

图5 川芎嗪联合BMSCs对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

表3 川芎嗪联合BMSCs对脑缺血大鼠Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

Table 3.The effect of TMP combined with BMSCs on the protein expression of Bcl-2 and Bax in the rats with cerebral ischemia (Mean±SD.n=6)

**P<0.01 vs model; ##P<0.01 vs TMP+BMSCs.

BMSCs移植治疗脑缺血的作用机制非常复杂，除了分化替代和旁分泌作用参与神经修复外，还能抑制缺血周边区神经细胞凋亡[5]。细胞凋亡受特定的基因调控，其中Bcl-2家族在细胞凋亡中发挥重要作用。Bcl-2是一种凋亡抑制蛋白，Bax可对抗Bcl-2，促进细胞凋亡，Bcl-2/Bax比值决定细胞受到凋亡信号刺激后是存活还是凋亡[16]。脑缺血后Bcl-2表达下降和Bax表达增加促进神经细胞凋亡，上调Bcl-2表达或Bcl-2/Bax比值可抑制神经细胞凋亡[4]。有研究报道，奥拉西坦联合BMSCs较两者单用能显著减少脑缺血后神经细胞凋亡，上调Bcl-2表达[17]。本研究结果发现，BMSCs和川芎嗪均能上调脑缺血大鼠Bcl-2表达和下调Bax的表达，减少神经细胞凋亡，但川芎嗪和BMSCs的联合应用能够显著减少神经细胞的凋亡，上调脑缺血后大鼠Bcl-2和下调Bax mRNA和蛋白的表达，其作用效果显著优于BMSCs和川芎嗪的单独治疗组。

综上所述，川芎嗪联合BMSCs移植能促进脑缺血后大鼠的神经功能恢复，减少梗死体积，减轻脑组织缺血性损伤，抑制神经元细胞凋亡，其机制可能与调控Bcl-2、Bax的表达有关。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Tetramethylpyrazine combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation inhibits neuronal apoptosis in rats with cerebral ischemia

DING Wen-qian1, LI Lin2, CHU Li-sheng2, REN Cui-cui1, FANG Yan2, YANG Yan2

(1CollegeofPharmacy,2CollegeofBasicMedicalSciences,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China.E-mail:chulisheng@21cn.com)

AIM: To investigate the effects of tetramethylpyrazine (TMP) combined with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on neuronal apoptosis, and Bcl-2 and Bax expression in rats with cerebral ischemia. METHODS: The BMSCs were isolated by the whole bone marrow adherent method and cultured, and those in the 3rd passage were used for tail-vein transplantation. The rats were subjected to right middle cerebral artery occlusion (MCAO) using suture method, and the rats except sham group were randomly divided into model group, BMSCs (1×109cells/L) group, TMP (40 mg/kg) group and combination (TMP+BMSCs) group with 12 rats in each group. Neurological function was evaluated by modified neurological severity scoring (mNSS) on 1 d, 7 d and 14 d after cerebral ischemia. Toluidine blue staining was performed to detect cerebral infarct volume, HE staining was used to observe brain histopathological change, neuronal apoptosis was observed by TUNEL staining, and the mRNA and protein expression of Bcl-2 and Bax was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot at 14 d after cerebral ischemia. RESULTS: Compared with BMSCs group and TMP group, TMP combined with BMSCs significantly reduced the score of mNSS (P<0.01) and the infarct volume (P<0.01), alleviated the pathological damage in the peripheral area of cerebral ischemia, decreased the number of TUNEL positive cells (P<0.01), increased the expression of Bcl-2 and decreased the expression of Bax at mRNA and protein levels (P<0.01). CONCLUSION: Tetramethylpyrazine combined with transplantation of BMSCs improves the functional recovery, reduces the infarct volume, relieves the ischemic injury of the brain tissue, and attenuates neuronal apoptosis in the rats with cerebral ischemia. The mechanism may be related to regulating the expression of Bcl-2 and Bax.

Tetramethylpyrazine; Bone marrow mesenchymal stem cells; Cerebral ischemia; Apoptosis

1000- 4718(2016)11- 1984- 06

2016- 04- 19

2016- 08- 26

国家自然科学基金资助项目(No. 81274113)；浙江省公益技术应用研究计划(No. 2016C33185)；浙江省教育厅科研项目(No. Z201016310)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.011

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel： 0571-86633149； E-mail： chulisheng@21cn.com