C-反应蛋白诱导人肾小管上皮细胞凋亡*

谢恺庆， 杨海波， 林洪升， 陈 丽， 霍冬梅， 史应龙， 覃诗雁， 周红卫

(广西医科大学 1第一附属医院肾内科暨血液净化部，2微生物学教研室， 广西 南宁 530021)



C-反应蛋白诱导人肾小管上皮细胞凋亡*

谢恺庆1△， 杨海波2， 林洪升2， 陈 丽1， 霍冬梅1， 史应龙1， 覃诗雁1， 周红卫1

(广西医科大学1第一附属医院肾内科暨血液净化部，2微生物学教研室， 广西 南宁 530021)

目的： 探讨与微炎症状态相应的C-反应蛋白(CRP)水平是否诱导肾小管上皮细胞凋亡。方法:以微炎症状态相应的CRP浓度刺激HK-2细胞。采用AnnexinⅤ-FITC、PI染色和流式细胞术检测凋亡细胞的百分率。采用Hoechst 33258染色观察肾小管上皮细胞凋亡的形态学改变。比色法检测细胞caspase-3活性。Real-time PCR检测促凋亡基因bax、抗凋亡基因bcl-2 的mRNA表达。结果:CRP呈剂量和时间依赖性地诱导HK-2 细胞凋亡，细胞凋亡在CRP浓度为10 mg/L时达高峰，在20 mg/L时则以晚期凋亡和坏死为主。Hoechst 33258细胞核染色显示CRP作用的HK-2细胞呈现染色质浓缩、碎裂或染色质边集等细胞凋亡的特点。CRP增高细胞caspase-3的酶活性、上调促凋亡基因bax的表达和下调抗凋亡基因bcl-2的表达。结论:CRP轻度增高可诱导肾小管上皮细胞凋亡。

C-反应蛋白； 肾小管上皮细胞； 细胞凋亡

肾小管间质纤维化是各种慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)发展至终末期肾衰竭的共同途径,是决定肾脏疾病预后的主要因素[1]。肾小管间质纤维化表现为肾小管萎缩缺失、细胞外基质在肾间质过度沉积以及炎症细胞浸润。在损伤因子作用下，肾小管上皮细胞呈隐匿而累积性的过度凋亡，是导致肾小管萎缩缺失和小管间质纤维化的主要原因之一[2]。慢性炎症在CKD肾功能丧失中扮演主要作用，炎症引起肾小管间质进行性纤维化以及肾小管萎缩，最终肾单位完整性被破坏，肾功能丧失。

慢性肾脏病患者中普遍存在全身慢性微炎症状态并且随着肾功能的下降而加重，表现为C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)等血清炎症标志物持续低水平增高[3]。对CKD肾活检发现CRP普遍沉积于肾小管和肾间质中[4-5]。CRP是人类主要的急性期反应蛋白，其不但是敏感的炎症标志物，还是炎症介质，可直接参与调控炎症和纤维化过程[6-7]。CRP作为一种活性的炎症蛋白，可诱导血管内皮细胞和平滑肌细胞凋亡[8-9]。CRP是否可以诱发肾小管上皮细胞凋亡而影响肾小管间质纤维化目前仍不清楚。我们以体外培养的人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞为靶细胞，观察类似体内CKD微炎症状态下的CRP浓度是否可诱导肾小管上皮细胞凋亡，从而阐述CRP在CKD进展中潜在的作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

人近端肾小管上皮细胞的永生系细胞株HK-2细胞购自ATCC。重组人CRP购自Calbiochem；DMEM/F12培养基和胎牛血清购自Gibco BRL； Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自Bender Med Systems；Hoechst 33258试剂盒和caspase-3活性检测试剂盒购自中国南京凯基生物试剂公司；总RNA提取试剂盒购自QIAGEN；反转录及real-time PCR试剂盒购自TaKaRa；羊抗人CRP抗体购自Santa Cruz。

2 方法

2.1 细胞培养 HK-2细胞在37 ℃水浴复苏后，以每孔1×105细胞接种于6孔板，在37 ℃、5% CO2条件下用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。 待细胞生长至70%～80%融合时改为无血清DMEM/F12培养，使其生长同步化后进行实验。

2.2 Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)双染色检测细胞凋亡 以不同浓度(0、0.1、1、10、20 mg/L)CRP以及CRP 10 mg/L +抗CRP抗体10 mg/L作用 HK-2细胞48 h，无血清DMEM/F12培养基培养细胞为阴性对照。另外用CRP 10 mg/L 处理HK-2细胞不同时间(0 h、12 h、24 h、48 h)。用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，Annexin V-FITC和 PI双染色细胞后，流式细胞术检测凋亡细胞。

2.3 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡 HK-2细胞接种于预先放在6孔培养板内的盖玻片上。以含1、10 mg/L CRP的无血清DMEM/F12培养基培养48 h，以不含CRP的无血清培养基为阴性对照。盖玻片用4%多聚甲醛溶液4 ℃固定10 min，加入终浓度2 mg/L的Hoechst 33258染色液，37 ℃避光孵育5 min。荧光显微镜下观察凋亡细胞。

2.4 Caspase-3活性的比色法检测 用10 mg/L CRP处理HK-2细胞0、6、12、24 h，收集细胞检测caspase-3活性。Caspase-3活性采用比色法测定。HK-2细胞用胰蛋白酶消化和收集，重悬在50 μL冰冷lysis buffer(50 mmol/L HEPES、1 mmol/L DTT、0.1 mmol/L EDTA、0.1% CHAPS，pH 7.4)中，4 ℃ 10 000×g离心1 min后，吸取细胞裂解上清液，根据试剂盒说明书进行caspase-3活性检测。

3 统计学处理

实验重复3次，数据以均数±标准差(mean±SD)表示。经正态性检验，所有定量变量符合正态分布。多组均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，均数间两两比较采用SNK-q检验。所有统计应用SPSS 13.0统计软件进行。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 流式细胞术检测CRP诱导肾小管上皮细胞凋亡

CRP以剂量依赖方式诱导HK-2 细胞凋亡(P<0.01)，早期凋亡在CRP浓度为10 mg/L达高峰，CRP浓度为20 mg/L时，细胞以晚期凋亡和坏死为主。加入抗CRP抗体中和CRP后，CRP诱导肾小管上皮细胞凋亡的作用显著下降(P<0.01)，见图1。HK-2细胞用含10 mg/L CRP的无血清DMEM/F12培养基培养0 h、12 h、24 h、48 h显示，CRP以时间依赖方式诱导HK-2 细胞凋亡(P<0.01), 细胞凋亡在24 h开始增高，48 h进一步增高。晚期凋亡和坏死在48 h亦显著增加, 见图2。

Figure 1. CRP induced apoptosis of HK-2 cells in a dose-dependent manner detected by Annexin V-FITC-PI staining. HK-2 cells were treated with 0 (A), 0.1 (B), 1 (C), 10 (D), 20 (E) mg/L CRP, and CRP (10 mg/L) in the presence of anti-human 10 mg/L CRP IgG (F) for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;##P<0.01vsCRP 10 mg/L.

图1 流式细胞术检测CRP诱导的肾小管上皮细胞凋亡的剂量效应

Figure 2.CRP induced apoptosis of HK-2 cells in a time-dependent manner detected by Annexin V-FITC-PI staining. HK-2 cells were incubated with CRP (10 mg/L) at 0 h (A), 12 h (B), 24 h (C) and 48 h (D). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h.

图2 流式细胞术检测CRP诱导的肾小管上皮细胞凋亡的时间效应

2 Hoechst 33258染色检测CRP诱导肾小管上皮细胞凋亡

图3显示，随着CRP刺激剂量增加，肾小管上皮细胞表现出凋亡的特点，光学显微镜下见细胞皱缩变圆，与邻近细胞脱离，折光能力增加，核仁裂解；Hoechst 33258染色见细胞核染色质浓缩或碎裂，部分呈核染色质边集。

Figure 3. CRP induced apoptosis of HK-2 cells determined by Hoechst 33258 staining (×200).

图3 Hoechst 33258核染色检测CRP诱导的肾小管上皮细胞凋亡

3 CRP诱导肾小管上皮细胞caspase-3酶活性增高

HK-2细胞用含10 mg/L CRP的无血清DMEM/F12培养基培养0 h、6 h、12 h、24 h，结果如图4所示，caspase-3活性呈时间依赖性增高(P<0.01)，12 h和24 h较对照组差异有统计学显著性(P<0.05)，12 h和24 h之间差异无统计学显著性。

Figure 4.Caspase-3 activity induced by CRP. HK-2 cells were incubated with CRP (10 mg/L) at different time points. Caspase-3 activity were measured by colorimetric assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h.

图4 CRP诱导的肾小管上皮细胞caspase-3酶活性变化

4 CRP影响肾小管上皮细胞凋亡基因bax和bcl-2的表达

HK-2细胞用含10 mg/L CRP的无血清DMEM/F12培养基培养0 h、12 h、24 h、48 h，CRP以时间依赖方式影响凋亡相关基因bax和bcl-2的mRNA表达，Bax mRNA的表达随时间延长而上调，24 h 达高峰，但48 h 较24 h下降(P<0.05)，见图5。Bcl-2 mRNA的表达随时间延长而下调，12 h显著性下降，48 h进一步下降(P<0.01)，见图6。

Figure 5.CRP induced the mRNA expression of Bax in the HK-2 cells. HK-2 cells were incubated with CRP (10 mg/L) at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h.

图5 CRP诱导的肾小管上皮细胞Bax mRNA的表达

讨 论

细胞凋亡最早被认为是一种清除机体衰老或无用细胞的生理性机制，现在认识到许多病理过程都出现细胞凋亡，如缺血性或肾毒性的肾损伤，梗阻性肾病和多囊肾等[10-15]。在多种进展性慢性肾脏病动物模型中，肾小管萎缩和肾间质纤维化的程度与肾小管上皮细胞的凋亡率密切相关，肾小管上皮细胞凋亡在进行性肾功能减退和进行性肾小管萎缩和肾间质纤维化中起重要作用[16-18]。晚期慢性肾脏病病理表现为肾小管萎缩和肾间质纤维化。肾小管细胞在各种损伤因子作用下发生凋亡，导致小管细胞形态改变和缺失，肾小管细胞缺失、进一步加重肾小管间质纤维化[2]。

Figure 6.CRP induced the mRNA expression of Bcl-2 in the HK-2 cells. HK-2 cells were incubated with CRP (10 mg/L) at different time points. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h.

图6 CRP诱导肾小管上皮细胞Bcl-2 mRNA的表达

CRP作为一种活性的炎症蛋白，可诱导血管内皮细胞和平滑肌细胞凋亡[8-9]。本实验亦发现，CRP可诱导肾小管上皮细胞凋亡，并且呈剂量和时间依赖性反应。在10 mg/L CRP刺激下，细胞凋亡显著增高，而生理浓度1 mg/L与对照比较无显著差异。在慢性肾衰竭时，一般血清CRP浓度超过5～10 mg/L,而小于100 mg/L。在正常状态下，CRP分子量为105 kD，无法透过肾小球滤过膜滤出，但出现肾小球病变时，肾小球滤过膜通透性增高，CRP可滤出进入肾小管，在原尿中如果CRP未被肾小管上皮细胞重吸收，其浓度接近血清水平。我们采用浓度为10 mg/L 的CRP可诱导肾小管上皮细胞凋亡，提示随着慢性肾脏病患者肾功能的下降，血循环中升高的CRP可透过肾小球滤过膜刺激近端肾小管上皮细胞凋亡。

Caspase家族是一类在细胞凋亡过程中被激活的半胱氨酸蛋白酶家族，它的激活与超常表达均引起细胞凋亡。目前已确定的caspase家族成员有14种。其中caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志[19]。本研究结果显示，在CRP诱导的HK-2细胞凋亡中，caspase-3蛋白酶活性增高，表明CRP诱导HK-2细胞凋亡是通过激活caspase-3，启动caspase级联反应而实现的。

Bcl-2家族是凋亡相关基因家族，分为致凋亡基因(bax、bak、bad等)和抗凋亡基因(bcl-2、bcl-x等)[20]。在肾小管上皮细胞中，Bcl-2和Bax蛋白均存在线粒体膜上。而Bax与Bcl-2有很高同源性，两者形成异源二聚体，Bax抑制Bcl-2活性，促进细胞凋亡，其主要机制与诱导线粒体损伤而触发细胞凋亡有关[21-22]。 用浓度为10 mg/L 的CRP处理肾小管上皮HK-2细胞，可见Bcl-2 mRNA的表达受到抑制，随刺激时间的延长mRNA的表达降低, 而Bax mRNA的表达增强, 随刺激时间的延长升高，提示低水平CRP可通过线粒体途径诱导肾小管上皮细胞凋亡。同时我们发现48 h Bax mRNA的表达显著性降低，这可能与已走向凋亡的细胞中不表达或低表达Bax有关[23]。

综上所述，体外实验发现低水平CRP可诱导肾小管上皮细胞凋亡，提示微炎症状态下CRP具有引起肾小管细胞缺失而加重肾小管萎缩和间质纤维化的作用。诱导凋亡的机制与caspase-3凋亡酶活化、促凋亡基因bax上调、抗凋亡基因bcl-2下调有关。

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

C-reactive protein induces apoptosis in human renal tubular epithelial cells

XIE Kai-qing1, YANG Hai-bo2, LIN Hong-sheng2, CHEN Li1, HUO Dong-mei1,SHI Ying-long1, QIN Shi-yan1, ZHOU Hong-wei1

(1RenalDivisionofTheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofMicrobiology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail: 1533459363@qq.com)

AIM: To explore whether the C-reactive protein (CRP) level in microinflammation state induces the apoptosis of renal tubular epithelial cells. METHODS: HK-2 cells were stimulated with recombinant human CRP. Annexin-FITC-PI staining and flow cytometry were used to detect the percentage of apoptotic cells. Morphology observation of apoptosis was assessed by Hoechst 33258 staining. Caspase-3 activity was measured by a colorimetric assay. The expression of apoptotic genebaxand anti-apoptotic genebcl-2 at mRNA levels was determined by real-time PCR. RESULTS: CRP induced apoptosis of HK-2 cells in a time- and dose-dependent manner. The maximal apoptotic effect of CRP concentration was 10 mg/L CRP at concentration of 20 mg/L. CRP treatment was associated with the characteristic morphological features of apoptosis such as condensation, fragmentation or margination of nuclear chromatin. CRP exposure increased caspase-3 activity, up-regulated the mRNA expression of Bax and down-regulated the mRNA expression of Bcl-2. CONCLUSION: Slightly increased CRP level has the potential to induce apoptosis of renal tubular cells.

C-reactive protein; Renal tubular epithelial cells; Apoptosis

1000- 4718(2016)11- 2020- 06

2016- 06- 01

2016- 07- 25

广西自然科学基金资助项目(No. 2013GXNSFAA019149)；广西高校科研立项项目(No. 201204LX054)

R691.3; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.017

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0771-5356710; E-mail： 1533459363@qq.com