反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中奥沙利铂的质量浓度

刘 剑，张志清，杨秀岭

（河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000）

反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中奥沙利铂的质量浓度

刘 剑，张志清，杨秀岭

（河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000）

目的 建立测定大鼠血浆中奥沙利铂质量浓度的反相高效液相色谱（RP－HPLC）法。方法 色谱柱为DiamonsilTMC18柱（250 mm× 4．6 mm，5 m），流动相为乙腈－水（7∶93），检测波长为210 nm，流速为0．8m L／min，柱温为30℃，进样量为20 L。结果 奥沙利铂保留时间为8．51min，标准曲线方程为 Y＝8 035．7X－11 791（r＝0．999 5），线性范围为2．0～160．0 g／mL。低、中、高3个质量浓度奥沙利铂血浆样品的方法回收率分别为（112．7±3．61）%，（102．8±3．33）%，（101．6±4．60）%，RSD分别为3．20%，3．24%，4．53%；低、中、高3个质量浓度奥沙利铂血浆样品的提取回收率分别为（79．84±2．01）%，（82．29±3．28）%，（84．89±3．35）%，RSD分别为2．51%，3．98%，3．95%。血浆样品在－40℃反复冻融3次后性质稳定，对测定无影响。测定10只大鼠血浆样品中奥沙利铂的平均质量浓度为（67．4±10．45） g／m L。结论 该方法准确、简便、灵敏度高、重复性好，可为大鼠血浆中奥沙利铂的质量浓度测定提供方法学参考。

反相高效液相色谱法；大鼠；血浆；奥沙利铂；血药浓度

奥沙利铂（L－OHP）为第3代铂类抗癌药物，毒性较低，安全性良好，是大肠癌的有效抗肿瘤药物，美国食品药物管理局（FDA）于2004年1月批准了奥沙利铂联合方案作为晚期结直肠癌的一线方案[1]。此外，奥沙利铂对卵巢癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、头颈部肿瘤等也有客观疗效[2]。关于奥沙利铂主药含量测定及杂质和其他成分测定已有相关报道[3－7]，新剂型脂质体中含量测定也有部分研究[8－9]，但未见大鼠体内奥沙利铂质量浓度测定方法的研究。为此，本研究中采用反相高效液相色谱－紫外检测法（RP－HPLC－UV）测定大鼠血浆样品中奥沙利铂的药物浓度，并探索和改进方法，为今后研究提供方法学参考。

1 仪器、试药与动物

Waters高效液相色谱仪，包括Waters－515型高压泵、7725i型进样阀（Rhedyne）、Waters－486型紫外检测器、Empower Application型操作平台（美国 Waters公司）；CPA2250型电子天平（Sartorius）；MDF－U2086S型低温冰箱（日本三洋）；XW－80A型涡旋混合器（上海精科实业有限公司）；D37520型高速离心机（美国雅培）；AP－01P型抽滤泵（天津市协同仪器有限公司）；KQ－300B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。注射用奥沙利铂（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号为13011311）；奥沙利铂对照品（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号为619111204，纯度99．8%）；帕洛诺司琼（欧赛，齐鲁制药＜海南＞有限公司，批号为B1G1206005）；乙腈为色谱纯，高氯酸溶液为分析纯，蒸馏水。健康W istar大鼠，清洁级，雄性，体重（170±10）g，均由河北省实验动物中心提供，许可证号为SCXK（冀）2008－1－003。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：DiamonsilTMC18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；流动相：乙腈－水（7∶93）；检测波长：210 nm；流速：0．8mL／min；柱温：30℃；进样量：20μL。

2．2 溶液制备

精密称取奥沙利铂对照品200．0mg，置100m L容量瓶中，加水至刻度并摇匀，得质量浓度为2 000．0μg／mL的奥沙利铂贮备液；分别精密量取奥沙利铂贮备液适量，制成质量浓度为 1 600．0，1 000．0，800．0，500．0，200．0，100．0，50．0，20．0μg／mL的系列对照品溶液。

2．3 血浆样品处理

空白血浆制备：大鼠眼眶取血，将所取空白血置涂有肝素的离心管中，离心2 min(10 000 r／min)，吸取上清液，即得空白血浆，立即贮存于－40℃的冰箱，备用。

血浆样品处理：取血浆200μL，置2 m L塑料离心管中，加入6%高氯酸溶液160μL，涡旋振荡0．5 min，离心2 min（10 000 r／min），吸取上清液20μL进样，并采用高效液相色谱（HPLC）法分析。

2．4 方法学考察

专属性试验：将奥沙利铂对照品溶液直接进样；另取空白血浆、空白血浆＋奥沙利铂对照品及血浆样品按拟订方法处理并测定，记录色谱图，见图1。结果表明，血浆中内源性物质不干扰奥沙利铂的测定，色谱峰分离良好，奥沙利铂的保留时间为8．51min。

图1 高效液相色谱图

标准曲线制备：精密量取2．2项下不同质量浓度的对照品溶液20μL，置2m L塑料离心管中，加入空白血浆180μL，制成质量浓度分别为160．0，100．0，80．0，50．0，20．0，10．0，5．0，2．0μg／m L的模拟血浆样品，按拟订方法处理并测定。以奥沙利铂峰面积（Y）对血浆药物质量浓度（X）进行线性回归，得标准曲线回归方程Y＝8 035．7X－11 791，r＝0．999 5（n＝8）。结果表明，奥沙利铂检测质量浓度在2．0～160．0μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。定量下限为2μg／m L。

精密度试验：精密量取质量浓度为50，200，1000μg／m L的奥沙利铂对照品溶液20μL各5份，加入180μL空白血浆，制成5．0，20．0，100．0μg／m L3种质量浓度的奥沙利铂模拟血浆样品，按拟订方法处理并测定，于同日内测定5次，计算日内 RSD；另每日测定1次，连续测定5 d，计算日间RSD。结果见表1。

表1 精密度试验结果（s，n＝5）

表1 精密度试验结果（s，n＝5）

日内精密度 日间精密度加入量（ g／m L）5．0 20．0 100．0测得量（ g／mL）5．7±0．23 20．6±0．66 100．0±4．35 RSD（%）4．07 3．21 4．35测得量（ g／m L）5．7±0．21 20．6±0．66 99．9±2．88 RSD（%）3．64 3．23 2．88

稳定性试验：精密量取质量浓度为200．0μg／mL的奥沙利铂对照品溶液20μL，加入180μL空白血浆，制成质量浓度为20．0μg／m L的奥沙利铂模拟血浆样品，按拟订方法处理，处理时间分别为即刻处理和反复冻融3次后处理，结果的 RSD为1．67%。另外，同上操作配制质量浓度为20．0μg／mL的奥沙利铂模拟血浆样品即刻处理后，分别在室温和0℃放置0，0．5，1，2，3，4 h后测定并计算，结果的 RSD分别为41．85%和7．15%，表明奥沙利铂在室温放置环境下不稳定，在其他考察条件下性质稳定。

回收率试验：精密量取质量浓度为50．0，200．0，1 000．0μg／mL的奥沙利铂对照品溶液20μL各5份，加入180μL空白血浆，制成5．0，20．0，100．0μg／m L 3种质量浓度的奥沙利铂模拟血浆样品各5份，按拟订方法处理并测定，测得峰面积（A）并代入标准曲线方程，求得奥沙利铂实际质量浓度（B），并与配制质量浓度（C）做比较，计算方法回收率（B／C）。精密量取质量浓度为50．0，200．0，1 000．0μg／mL的奥沙利铂对照品溶液20μL各5份，加入180μL蒸馏水，制成5．0，20．0，100．0μg／m L 3种质量浓度的奥沙利铂样品各5份，按拟订方法处理并测定，测得峰面积（D），然后计算提取回收率（A／D）。结果见表2。

表2 奥沙利铂回收试验结果（s，%，n＝5）

表2 奥沙利铂回收试验结果（s，%，n＝5）

方法回收率加入量 提取回收率（ g／m L）5．0 20．0 100．0回收率112．7±3．61 102．8±3．33 101．6±4．60 RSD 3．20 3．24 4．53加收率79．84±2．01 82．29±3．28 84．89±3．35 RSD 2．51 3．98 3．95

2．5 血浆样品测定

精密称取注射用奥沙利铂50．0mg，溶于7m L蒸馏水中，制备相应质量浓度的奥沙利铂溶液。取大鼠10只，根据文献[10]推算大鼠给药量，奥沙利铂为23．1mg／kg，用1mL注射器尾静脉给药，且均在给药后即刻由眼底静脉丛取血 0．5 m L，置涂有肝素的离心管中，离心2 min(10 000 r／min)，吸取上清液即刻按拟订方法处理，分别进行测定。结果10只大鼠血浆样品中奥沙利铂的质量浓度分别为65．2，62．2，71．5，58．6，77．6，59．7，47．6，77．6，78．6，75．8μg／mL，平均质量浓度为（67．4±10．45）μg／mL。

3 讨论

3．1 流动相的选择

比较了甲醇－水和乙腈－水，结果表明，选用甲醇－水作流动相时，血浆杂质峰较多，不能与奥沙利铂色谱峰较好地分离；而选用乙腈－水作流动相时，可得到峰形良好的单峰，且与血浆内源性物质分离完全，保留时间适中，有利于试验顺利进行。故选用乙腈－水(7∶93)为流动相。

3．2 血浆样品的处理

因流动相中含有乙腈，故拟订使用乙腈沉淀蛋白，经试验发现，用乙腈沉淀蛋白处理血浆样品时奥沙利铂测得质量浓度很小，不利于样品的测定。郑仁娟等[11]的研究结果显示，奥沙利铂最稳定的pH为4．2，偏酸或偏碱均会加速其水解。赵雁等[12]的研究结果显示，改用6%高氯酸溶液沉淀蛋白效果良好，奥沙利铂的质量浓度有明显改善，有利于样品的测定。

3．3 方法学考察

考虑到药物在大鼠全血中会降解[12－13]，以及经处理后在室温放置下性质不稳定，为避免样品测定受到影响，所有血浆样品应即刻处理即时测定。

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[2]宋晓坤，杜春双，巴 一，等．两种剂量下血浆中不同形式奥沙利铂的药动学[J]．中国医院药学杂志，2009，29（12）：980－983．

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M ass Concentration Determ ination of Oxalip latin in Plasm a of Rats by RP－HPLC

Liu Jian，Zhang Zhiqing，Yang Xiuling
（The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei，China 050000）

Objective To establish a RP－HPLC method for determining the mass concentration of oxaliplatin in plasma of rats．M ethods The DiamonsilTMC18column（250 mm×4．6 mm，5μm）was used with mobile phase consisted of acetonitrile－water（7∶93）at the flow rate of 0．8 mL／min，the detection wavelength was set at 210 nm and column temperature was 30℃，and the injection volume was 20μL．Resu lts The retention time of oxaliplatin was 8．51 min．the standard curve was Y＝8 035．7 X－11 791（r＝0．999 5）with a linearity range of 2．0－160．0 μg／mL．The recovery rate of method of low，midd le and high concentration were（112．7± 3．61）%，（102．8±3．33）%，（101．6±4．60）%，RSD were 3．20%，3．24% and 4．53%，respectively；the recovery rate of extraction of low，middle and high concentration were（79．84±2．01）%，（82．29±3．28）%，（84．89±3．35）%，RSD were 2．51%，3．98% and 3．95%，respectively．The plasma samples were stable when stored at－40℃ for freeze－thaw for thrice and the processed samples were stable，but were unstable at room temperature．The average of plasma concentration in 10 rats were（67．4±10．45）μg／mL．Conclusion The method is accurate，simple and has high sensitivity and reproducibility．It can provide methodology reference for the determination of oxaliplatin concentration in plasma of rats．

RP－HPLC；rats；plasma；Oxaliplatin；plasma concentration

R965；R979．1

A

1006－4931(2016)04－0054－03

刘剑（1979－），硕士研究生，主管药师，研究方向为药动学和药物体内相互作用，（电话）0311－66003452（电子信箱）ljhaiyang＠aliyun．com。

2015－07－05)