Siah2负调控脯氨酰羟化酶3表达在大鼠低氧性肺动脉高压中的意义

潘 坤 戴爱国 张泽明 陈云荣 尹文斌 杜 宇

(河北大学附属医院呼吸内科，河北 保定 071000)



Siah2负调控脯氨酰羟化酶3表达在大鼠低氧性肺动脉高压中的意义

潘 坤 戴爱国1张泽明 陈云荣1尹文斌 杜 宇

(河北大学附属医院呼吸内科，河北 保定 071000)

目的 探讨Siah2及低氧诱导因子(HIF)脯氨酰羟化酶(PHD)3的表达变化趋势在大鼠低氧性肺动脉高压(HPH)中的作用和意义。方法 40只成年雄性SD大鼠随机划分常氧正常组和低氧3 d、7 d、14 d和21 d组，每组8只，常压低氧制作HPH大鼠模型。RT-PCR检测Siah2和PHD3 mRNA表达变化，Western印迹检测上述两指标的蛋白质表达，并分析其表达变化与大鼠HPH的关系。结果 常氧正常组Siah2 mRNA表达水平较低，低氧7 d后显著增高(P<0.05)，低氧14 d达高峰;常氧正常组及低氧3 d组Siah2蛋白表达亦较低，低氧7 d后显著增高(P<0.05)，低氧14 d达高峰。常氧正常组PHD3 mRNA和蛋白质表达均不明显，低氧3 d mRNA明显增高(P<0.05)，同时随低氧时间延长其mRNA表达逐渐升高并保持在高水平；PHD3蛋白质低氧3 d明显增高(P<0.05)，低氧7 d保持高水平，低氧14 d和21 d下降。相关分析表明，肺小动脉壁Siah2 蛋白质表达水平与Siah2 mRNA呈正相关(r=0.87，P<0.01),与PHD3蛋白表达水平呈负相关(r=-0.44，P<0.05)。结论 Siah2与PHD3均在大鼠HPH的发病机制中发挥作用。Siah2可能从蛋白水平下调PHD3的表达水平，导致HPH的发生发展。

脯氨酰羟化酶3；Siah2；低氧性肺动脉高压

低氧诱导因子(HIF)-1α在慢性阻塞性肺疾病患者和低氧大鼠肺动脉高压形成过程中发挥非常重要的作用〔1，2〕。HIF-1α蛋白降解有一个前提条件，即脯氨酰羟化酶(PHD)3催化HIF-1α氧依赖性降解区域两个脯氨酸残基羟基化。因此，对HIF-1α蛋白表达水平的调控本质上就是对PHD3的调控。体外试验已发现Siah2可通过泛素-蛋白酶体途径介导PHD3的降解〔3〕。本实验通过观察Siah2与PHD3在低氧性肺动脉高压(HPH)大鼠模型肺小动脉血管壁中表达的动态变化，探讨二者在HPH发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 制作动物模型及实验分组 选用清洁级健康雄性SD大鼠40只制作HPH大鼠模型，体重(220±20)g，数字表法随机划分为常氧正常组，低氧3、7、14、21 d组，每组8只。常氧正常组放置于氧浓度正常的空气舱内，低氧组每天间断低氧8 h，氧浓度为(10.0±0.5)%，气压与大气压相等，五组大鼠饲养条件除低氧时间不同外，其余完全相同〔4〕。

1.2 实验方法 RT-PCR检测肺组织中Siah2、PHD3 mRNA的转录水平。0.1 g右肺组织，参照上海生物工程公司提供的TRIZOL试剂说明书提取总RNA，逆转录，按照下列参数行PCR，Siah2：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，反应37个循环，72℃延伸10 min。PHD3：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，反应30个循环，72℃延伸10 min。RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，对扩增产物条带吸光度做半定量分析。引物序列：PHD3正义CCTGATGACATTATCGCCTCT，反义AGCCTAGCGGTATGCGA，产物长度337 bp；Siah2正义ATGGGAACCTTGGAATCAATG，反义CACAGAACCACCTCCGAATTA，产物长度276 bp；β-actin正义CCTAAGGCCAACCGTGAA，反义CTAGGAGCCAGGGCAGTAATC，产物长度635 bp。

Western印迹检测肺组织中Siah2、PHD3蛋白表达。0.1 g大鼠右肺组织充分剪碎，加入RIPA裂解液冰浴匀浆，4℃10 000 r/min离心，去除沉淀物，获得肺组织总蛋白，将上述样品稀释成相等浓度分装，置于-80℃保存。实验时将上述等量蛋白质样品加至7.5%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶孔，200 V电压电泳，电泳完成后将蛋白转印到硝酸纤维膜，室温封闭2 h，加入1∶1 000稀释的一抗温育过夜，漂洗液冲洗后加入1∶2 000二抗室温杂交1 h，漂洗后化学发光试剂盒胶片显影，对蛋白条带吸光度行半定量分析。

1.3 结果评定 使用TanonGis-2010图像分析系统对RT-PCR和Western印迹产物条带做半定量分析，计算产物条带与内参照的吸光度比值。

1.4 统计学方法 应用SPSS16.0软件行单因素方差分析或q检验，相关分析采用简单直线相关。

2 结 果

2.1 Siah2 mRNA及蛋白在大鼠HPH肺组织的差异表达 Siah2 mRNA在常氧正常组大鼠肺组织有微量表达，低氧7 d后增高明显(P<0.05)，低氧14 d表达呈高峰，低氧21 d稍下降但仍高于正常组。Western印迹结果显示Siah2蛋白表达变化趋势与其mRNA的变化趋势相一致，常氧正常组大鼠肺组织有少量表达，低氧7 d明显升高(P<0.05)，低氧14 d到达峰值，低氧21 d有所回落但仍然高于正常组。见表1。

2.2 PHD3 mRNA及蛋白在大鼠HPH肺组织的差异表达 RT-PCR结果显示，PHD3 RNA在常氧正常组大鼠肺组织有微量表达，低氧3 d后迅速升高(P<0.05)，低氧14 d呈高峰表达，低氧21 d保持高水平。Western印迹结果显示PHD3蛋白表达变化趋势与其mRNA的变化趋势不一致，PHD3蛋白在正常组略有表达，低氧3 d明显增高(P<0.05)，低氧7 d保持在高水平，低氧14 d和21 d下降但仍高于正常组。见表1。

2.3 Siah2与PHD3表达的相关性 在4 个不同时间低氧组大鼠中，Siah2 蛋白质表达水平与Siah2 mRNA呈正相关(r=0.87，P<0.01),与PHD3蛋白表达水平呈负相关(r=-0.44，P<0.05)。

组别PHD3mRNAPHD3蛋白Siah2mRNASiah2蛋白常氧正常组0.125±0.0140.151±0.0140.062±0.0110.060±0.016低氧3d组0.256±0.0111)0.241±0.0261)0.066±0.0120.055±0.012低氧7d组0.263±0.0151)0.256±0.0251)0.142±0.0191)2)0.147±0.0191)2)低氧14d组0.287±0.0121)2)3)0.204±0.0221)2)3)0.179±0.0241)2)3)0.179±0.0201)2)3)低氧21d组0.292±0.0251)2)3)0.187±0.0241)2)3)0.127±0.0141)2)4)0.140±0.0191)2)4)F/P值141.765/0.00028.048/0.00075.029/0.00082.180/0.000

与常氧正常组比较:1)P<0.05；与低氧3 d组比较:2)P<0.05；与低氧7 d组比较:3)P<0.05；与低氧14 d组比较：4)P<0.05

3 讨 论

HIF-1是组织细胞中广泛存在的异二聚体核转录因子，由结构同源的α亚基和β亚基构成，调节上百种低氧适应性基因的表达，其表达的动态变化可引起下游靶基因表达的改变进而导致相应疾病。HIF-1的生理活性主要取决于HIF-1α亚基的活性和表达，HIF-1α mRNA在常氧时持续表达，但其蛋白可通过泛素-蛋白酶体途径迅速降解，触发HIF-1α蛋白降解的关键是PHD对其氧依赖性降解区域两个脯氨酸残基的羟基化。因此，对HIF-1α蛋白表达水平调控的本质就是对羟化酶的调控，而PHD3作为调节HIF-1α平衡和活性的重要蛋白，可作为有效的研究目标。

Siah蛋白是在哺乳动物中发现的一种E3泛素连接酶家族成员，具有泛素连接酶活性，可介导多种蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解，到目前为止，已有超过30余种的Siah蛋白作用底物被确定，包括近年研究发现的ELL2、突触蛋白、Zeb1、ACK1等各底物〔5～7〕，在人类有Siah1和Siah2两种亚型表达，离体细胞试验证实，Siah2可通过泛素-蛋白酶体途径介导PHD3的降解进而引起HIF-1α的累积〔8〕，但在肺动脉高压的发病过程中，上述作用机制是否同样存在还未明确。

已有研究表明，Siah2 mRNA在低氧、低糖、高糖、DNA损伤等条件下表达均可增加〔9〕。但低氧环境下Siah2 mRNA表达增加的机制目前尚不明确。HIF-1α在低氧条件下调节着上百种低氧适应性基因的表达，且HIF-1α在低氧条件下表达增加，HIF-1α是否同样调控了Siah2在低氧条件下表达增加目前尚无明确证据。Siah2蛋白在常氧正常组表达水平很低，原因可能是由于其强烈的自身泛素化作用介导了自身经泛素-蛋白酶体途径降解，从而导致其不易被检测到。Siah2 mRNA 与Siah2 蛋白质表达水平正相关,既然Siah2在低氧条件下表达增加，同时Siah2又存在众多的作用底物，它在低氧环境下也将调控其他众多作用底物的表达，提示Siah2表达的动态变化可能在HPH的发病过程中发挥作用。

本实验结果表明，PHD3蛋白可能存在翻译后水平的调控。有研究表明〔8〕，在人类293T细胞中，低氧时Siah2高表达可引起PHD3蛋白表达水平显著下降，而在 Siah2-/-小鼠胚胎成纤维细胞中，不管在常氧(21%氧浓度)还是低氧条件(2%氧浓度)下，PHD3表达都显著增加，HIF-1α 及其靶基因血管内皮生长因子(VEGF)表达也明显下降。Moller等〔10〕利用从果蝇蛋白中提取的基因片段，成功影响了Siah蛋白和PHD之间的反应，并抑制了PHD蛋白的降解，这些结果均为Siah2在翻译后水平对PHD3进行调控提供了基因学证据。本实验提示，在大鼠HPH形成过程中，慢性低氧可能通过诱导肺小动脉壁Siah2表达增加，进而降低PHD3蛋白表达水平，进一步减弱PHD3对HIF-1α转录活性的抑制，导致血管内皮生长因子(VEGF)等HIF-1α靶基因转录激活，从而参与 HPH 发生发展。

PHD3对常氧和低氧、生理和病理状态下HIF1-α蛋白质水平的调节都起决定性作用，可称之为HIF1-α降解的关键酶，明确PHD3的调控机制将有助于通过PHD3对HIF-1α进行精密调控，延缓甚至阻断HPH的进展。本研究推测，低氧环境下高表达的Siah2可能通过泛素-蛋白酶体途径对靶蛋白PHD3进行降解，从而正向调节HIF-1α的表达，并在肺动脉高压的形成过程中发挥生物学作用。

1 陈云荣，戴爱国，胡瑞成.一氧化氮抑制缺氧诱导因子α亚基表达对大鼠缺氧性肺动脉高压的作用〔J〕.中国病理生理杂志，2011;27(1)：14-21.

2 贺承健，邓立普.低氧对人肺腺癌细胞SPCA-1低氧诱导因子-1α和低氧诱导因子-2α的差异性调控作用〔J〕.中国全科医学，2011;14(33)：3833-6.

3 Simon MC.Siah proteins,HIF prolyl hydroxylases,and the physiological response to hypoxia〔J〕.Cell,2004;117(7):851-3.

4 Chen YR,Dai AG,Hu RC,etal.Differential and reciprocal regulation between hypoxia-inducible factor-alpha subunits and their prolyl hydroxylases in pulmonary arteries of rat with hypoxia-induced hypertension〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin,2006;38(6):423-4.

5 Zhao Y,Li Q,Jin A,etal.E3 ubiquitin ligase Siah-1 downregulates synaptophysin expression under high glucose and hypoxia〔J〕.Am J Transl Res,2015;7(1):15-27.

6 Chen AN,Wong CS,Liu MC,etal.The ubiquitin ligase Siah is a novel regulator of Zeb1 in breast cancer〔J〕.Oncotarget,2015;6(2):862-73.

7 Buchwald M,Pietschmann K,Brand P,etal.SIAH ubiquitin ligases target the nonreceptor tyrosine kinase ACK1 for ubiquitinylation and proteasomal degradation〔J〕.Oncogene,2013;32(4):4913-20.

8 Nakayama K,Ffew IJ,Hagensen M,etal.Siah2 regulates stability of prolyl-hydroxylases,controls HIF1alpha abundance,and modulates physiological responses to hypoxia〔J〕.Cell,2004;117(7):941-52.

9 Qi J,Kim H,Scortegagna M,etal.Regulators and effectors of Siah ubiquitin ligases〔J〕.Cell Biochem Biophys,2013;67(1):15-24.

10 Moller A,House CM,Wong CS,etal.Inhibition of Siah ubiquitin ligase function〔J〕.Oncogene,2009;28(2):289-96.

〔2015-11-19修回〕

(编辑 袁左鸣)

Down-regulation of prolyl hydroxylases 3 by Siah2 in rats with hypoxia-induced pulmonary hypertension

PAN Kun, DAI Ai-Guo, ZHANG Ze-Ming,et al.

Department of Respiratory, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei, China

Objective To study the dynamic expression of seven in absentia2 (Siah2)and prolyl hydroxylase 3 (PHD3)in rats with hypoxia-induced pulmonary hypertension (HPH).Methods Male SD rats(n=40)were randomly divided into normoxia normal, 3, 7, 14 or 21 d hypoxia groups respectively (n=8). HPH was made by atmospheric hypoxia. The expression levels of mRNA were measured by RT-PCR, Western blot was used to determine the expression of protein levels.Results Compared with normal group, Siah2 mRNA and protein levels were increased markedly after 7 d of hypoxia (P<0.05)and reaching its peak after 14 d of hypoxia.PHD3 mRNA was up-regulated after 3 d of hypoxia(0.256±0.011,P<0.05), and then remained at high levels, while PHD3 protein decreased after 14 d of hypoxia(0.204±0.022,P<0.05). Linear correlation analysis indicated that Siah2 protein was positively correlated with Siah2 mRNA (r=0.87，P<0.01)but negatively correlated with PHD3 protein (r=-0.44，P<0.05).Conclusions Siah2 and PHD3 are all involved in the pathogenesis of HPH in rats. Siah2 may down-regulate PHD3 by targeting it for proteasomal degradation.

Prolyl hydroxylase 3; Siah2; Hypoxia-induced pulmonary hypertension

国家自然科学基金(No.30971329)

1 湖南省老年医院 老年医学研究所呼吸疾病研究室

戴爱国(1966-)，男，博士后，博士生导师，主任医师，主要从事慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等研究。

潘 坤(1981-)，女，硕士，主治医师，主要从事阻塞性肺疾病、肺动脉高压研究。

R562

A

1005-9202(2016)23-5805-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.014