麦粒灸内关穴预处理对急性心肌缺血大鼠非特异性应激的影响

白 桦 张宏如 卢圣锋 张皓然 顾一煌

(南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京 210023)



麦粒灸内关穴预处理对急性心肌缺血大鼠非特异性应激的影响

白 桦 张宏如 卢圣锋 张皓然 顾一煌

(南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京 210023)

目的 观察麦粒灸内关穴预处理对急性心肌缺血大鼠非特异性应激的影响,探讨麦粒灸防治急性心肌损伤的作用机制。方法 将36只SD大鼠随机分为6组：空白对照组(K)、模型组(M)、麦粒灸1 d组(A)、麦粒灸2 d组(B)、麦粒灸3 d组(C)和麦粒灸5 d组(D)。采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备急性心肌缺血模型。K组：不做任何处理；M组：不做任何干预，直接制备急性心肌缺血模型；麦粒灸各组灸内关穴，1次/d，6壮/次，分别连续灸1 d、2 d、3 d、5 d，并于末次麦粒灸结束后制备急性心肌缺血模型。各组均于造模前后取血制备血清并分离心脏制备心脏切片行TTC染色。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定皮质醇(Cort)含量，采用免疫抑制法检测激酸肌酶同工酶(CK-MB)含量，ELISA检测心肌肌钙蛋白(cTnT)含量。结果 与K组相比，麦粒灸各组造模前血清Cort水平均增高(P<0.01)；M组、A组造模前血清CK-MB、cTnT升高，但无统计学意义(P>0.05)，B、C、D组造模前血清CK-Mb、cTnT均升高(P<0.05)。与K组相比，各组造模后血清Cort水平均增高(P<0.01)，血清CK-MB均升高(P<0.01)，血清cTnT均升高(P<0.05)。与M组造模后相比，麦粒灸各组造模后血清Cort水平均增高(P<0.05)，A组造模后血清CK-MB、cTnT升高，但无统计学意义(P>0.05)，B、C、D组造模后血清CK-MB、cTnT均升高(P<0.05)。A、B两组心肌缺血面积比值与M组相比显著降低(P<0.05)；E组心肌缺血面积比值与B组相比显著升高(P<0.05)。结论 麦粒灸内关穴预处理对防治急性心肌缺血具有有效性，其机制与改变非特异性应激反应的程度有关。

麦粒灸；心肌缺血；应激；心肌保护

针灸治疗能够有效地防治心血管疾病〔1，2〕，而艾灸防治冠心病的有效干预时间和机制研究却鲜有报道。本实验旨在研究麦粒灸内关穴预处理对急性心肌缺血大鼠是否具有保护作用，其发挥保护作用的机制是否与改变非特异性应激有关，并探讨不同干预的时间和刺激量对应激的影响是否具有差异性。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 采用雄性SD清洁级大鼠36只，体质量(250±30)g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供〔SCXX(沪)2013-0016〕，所有大鼠自由饮食，昼夜规律12 h/12 h,保持(25±2)℃室温和(50±5)%湿度，按照清洁级标准适应性喂养1 w，实验过程中对动物的处置符合关于善待实验动物的指导性意见。应用随机数字表法将36只SD大鼠随机分为6组：空白对照组(K)、模型组(M)、麦粒灸1 d组(A)、麦粒灸2 d组(B)、麦粒灸3 d组(C)和麦粒灸5 d组(D)，每组6只。

1.2 主要仪器与试剂 主要仪器有小动物呼吸机、台式高速冷冻离心机、数码相机(Nikon Lv-Tv，日本)。主要试剂有2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC,Sigma，USA)、磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒(南京建成生物工程研究所)、心肌肌钙蛋白(cTnT)定量检测ELISA试剂盒(Abcam公司)、皮质醇(Cort)定量检测酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(Abcam公司)。

1.3 干预方法 K组：不做任何处理；M组：不做任何干预，直接制备急性心肌缺血模型；A组：麦粒灸内关穴1次/d，6壮/次。后制备急性心肌缺血模型；B组：麦粒灸内关穴，1次/d，6壮/次，连续2 d。然后于末次麦粒灸结束后制备急性心肌缺血模型。C、D两组处理同B组。

1.4 标本制备 各组造模前均行眼眶取血1.5 ml制备血清；心肌缺血24 h后行股动脉取血1.5 ml制备血清，分离心脏制备心脏切片并行TTC染色。

1.5 急性心肌缺血模型制备 根据文献报道〔3〕的方法进行心肌缺血模型的制备：用10%水合氯醛溶液0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，使其仰卧位于(37±3)℃的实验板上，气管插管，调呼吸机呼吸频率为45～60次/min，潮气量为1.0 ml/100 mg。接心电监护仪，标准Ⅱ导联监测心电图，沿着第4、5肋间打开胸腔，用6.0的丝线结扎左前降支(LAD)，宽度、深度均约2 mm。造模成功的标准：缺血时以肢体Ⅱ导联ST段弓背上抬、T波高耸以及心脏表面变苍白或发绀显示心肌缺血形成。

1.6 麦粒灸方法 ①穴位定位：大鼠内关穴定位采用拟人比照法，按照《实验针灸学》记载，前肢内侧、离腕关节约3 mm的尺桡骨缝间。②灸法操作：将艾绒做成麦粒大小的艾炷(5 mg/壮)，用麦粒灸灸内关穴，6壮/次，1次/d，两侧穴位交替进行。

1.7 检测方法

1.7.1 TTC染色观察心肌缺血面积 将分离的心脏放于1×PBS溶液中清洗干净后，将心脏置于-20℃冰箱中冷冻20 min。待心脏冷冻固定后，将心脏置于切片器中，从心尖开始连续切1 mm的切片，一共5片。将5片心肌切片一起放入2%TTC-PBS溶液中37℃恒温避光15 min，随后放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h。采用数码相机对每片心肌组织进行拍照。采用IPWIN32分析软件对切片进行分析，TTC染色后梗死区为白色，未梗死区为砖红色。以梗死区面积/心肌总面积百分比衡量心肌缺血程度。

1.7.2 大鼠血浆Cort、cTnT和CK-MB含量的测定 将采集的血液3 500 r/min离心10 min分离血清，移液枪分别吸取上清0.5 ml至Eppendorf离心管内，-80℃冰箱冻存，采用酶联免疫吸附法测定血浆cort含量，采用免疫抑制法检测CK-MB含量，ELISA检测cTnT含量。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌缺血面积比较 A、B两组心肌缺血面积比值(0.400±0.023、0.345±0.012)与M组相比显著降低(0.548±0.067，P<0.05)；D组心肌缺血面积比值(0.575±0.05)与B组相比显著升高(P<0.05)。C组心肌缺血面积比值(0.439±0.022)与M组无显著差异(P>0.05)。见图1。

心肌白色区域为缺血区，砖红色区域为非缺血区图1 各组心肌缺血面积直观图

2.2 麦粒灸对急性心肌缺血大鼠cTnT和CK-MB含量的影响 血清cTnT含量：造模前，B、C、D组较M组与K组均明显升高(P<0.01，P<0.05)；C、D组较A、B组明显升高(P<0.01)，D组较C组明显升高(P<0.05)。造模后，与K组相比，M组明显升高(P<0.05)，麦粒灸各组均明显升高(P<0.01)；与M组相比，A、B、C、D组明显升高(P<0.05，P<0.01)；与A组相比，B、C、D组明显升高(P<0.01)；C、D组较B组明显升高(P<0.01)；D组较C组明显升高(P<0.01)。见表1。

组别造模前造模后K组30.74±1.5833.98±2.24M组33.31±3.6942.41±3.322)A组38.22±3.6953.28±5.841)3)B组45.12±5.591)3)66.34±7.191)3)4)C组58.50±8.361)3)4)5)82.92±5.701)3)4)5)D组67.58±9.181)3)4)5)6)94.58±7.231)3)4)5)6)

与K组比较:1)P<0.01，2)P<0.05；与M组比较:3)P<0.05；与A组比较:4)P<0.01；与B组比较:5)P<0.01；与C组比较:6)P<0.01

血清CK-MB含量：造模前，与K组相比，B、C、D组明显升高(P<0.05，P<0.01)；B、C、D组较M组明显升高(P<0.05，P<0.01)；C组较A组明显升高(P<0.05)；D组较A组明显升高(P<0.01)；D组较B、组明显升高(P<0.01，P<0.05)。造模后，与K组相比，其余各组均明显升高(P<0.01)；A、B、C、D组较M组均明显升高(P<0.01)；C、D组较A、B组均明显升高(P<0.01)；D组较C组明显升高(P<0.01)。见表2。

2.3 麦粒灸对急性心肌缺血大鼠Cort含量的影响 造模前，与K组相比，A、B、C、D组造模前均明显升高(P<0.01)；A、B、C、D组较M组升高(P<0.05，P<0.01)；D组较A、B组明显升高(P<0.01，P<0.05)。造模后，与K组相比，A、B、C、D组均明显升高(P<0.01)；B、C、D组较M组均明显升高(P<0.01)；C、D组较A组明显升高(P<0.01)；C、D组较B组明显升高(P<0.05，P<0.01)；D组较C组明显升高(P<0.01)。见表3。

组别造模前造模后K组4.95±0.225.01±0.31M组5.10±0.265.98±0.212)A组5.43±0.117.11±0.182)4)B组6.21±0.131)3)7.87±0.5382)4)C组6.78±0.332)4)5)8.85±0.722)4)6)7)D组8.02±1.472)4)5)7)10.94±0.362)4)6)7)8)

与K组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与M组比较:3)P<0.05，4)P<0.01；与A组比较:5)P<0.05，6)P<0.01；与B组比较:7)P<0.01；与C组比较:8)P<0.01；下表同

组别造模前造模后K组4.71±0.374.45±0.15M组4.52±0.186.99±0.40A组6.11±0.611)2)7.62±0.321)B组6.44±1.161)3)8.67±0.431)3)C组6.90±0.441)3)9.80±0.641)3)4)5)D组7.63±0.391)3)4)5)11.40±1.431)3)4)6)7)

3 讨 论

艾灸可通过其温通效应发挥通调血脉、通闭止痛、通滞散结的作用。有实验研究发现〔4〕艾灸具有双向调节的作用，既可以针对血脉瘀滞的情况而使血供增加、改善血管舒缩功能、保护血管细胞，发挥通畅的作用；又可以在血脉失衡状态的情况下，在生理范围内纠正其病理性亢进或抑制的失调，发挥稳定内环境等通调的作用。《神灸经论》曰：“取艾之辛作炷，能通十二经，入三阴，理气血，治百病”。麦粒灸是用小如麦粒大小的艾炷在穴位上施灸的一种治疗方法，可治疗临床各科慢性病与急性病，经络病与脏腑病等，凡寒热虚实者皆可灸之，具有整体调节的优势〔5〕。许慧倩等〔6〕研究发现，艾灸可通过促进小鼠疲劳运动后心肌细胞中组蛋白乙酰化酶P300、CREB结合蛋白(CBP)的表达，减少大量运动后小鼠心肌细胞的凋亡，从而发挥保护心脏的作用。

《灵枢·经脉篇》载：“心主手厥阴之脉，起于胸中，出属心包络，是主脉所生病者、烦心、心痛。”说明心包经与心脏在解剖、生理、病理等方面具有密切的联系。而内关穴络属手厥阴心包经，为本经络穴，又是八脉交会穴之一，通于阴维脉，具有宽胸解郁、宁心安神、理气止痛等功效，是治疗心胸疾病的要穴，素有“心胸内关谋”之说。研究发现缺血期持续电针“内关”穴50 min可以调节心肌缺血再灌注大鼠内皮素、心钠素、血栓素等血管活性物质，起到心肌保护的作用〔7〕。

应激是指当机体内环境稳态受到威胁时，机体对应激原产生特异性和(或)非特异性的反应，从而维持新的稳态。其根据应激源的不同可分为生理性应激(适度应激、良性应激)和病理性应激(过度应激、不良应激)〔8,9〕。当冠心病发生时，会引起机体一系列的应激反应：心肌缺氧时会使心肌交感神经末梢释放儿茶酚胺，大量的儿茶酚胺通过强烈的收缩冠状动脉，使心肌耗氧量增加进而诱发心肌缺血坏死的发生；另外还会使下丘脑-垂体-肾上腺皮质激素系统活性增强，引起全身的生理病理变化，产生病理性应激。针灸预处理指预先采取针灸的方法对一些穴位进行刺激，以提高机体的抵御与应变的能力，并产生减少随后疾病对机体组织器官损伤的作用〔10〕。有实验研究〔11～19〕显示针灸预处理对机体整体状态及应激激素、细胞凋亡等相关指标具有良性调节的作用，使机体产生适度的应激，提高机体维持内环境稳态的能力，激发身体的潜能，使机体处于一种预应激的状态，从而在预处理后的一段时间内对抗来自机体内部或外部的不良刺激，对机体的紊乱状态做出良性的调整，达到防病治病的目的。

本结果显示，麦粒灸内关直接灼伤肌肉组织从而影响cTnT和CK-MB的含量。

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〔2016-11-02修回〕

(编辑 曹梦园)

Effect of wheat-moxibustion pretreatment on Neiguan on acute myocardial ischemia rats with nonspecific stress

BAI Hua,ZHANG Hong-Ru,LU Sheng-Feng,et al.

The No.2 Clinical Medical School,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,Jiangsu,China

Objective To explore the mechanism of wheat-moxibustion in the treatment and prevention of acute myocardial injury by observing the effect of wheat-moxibustion pretreatment on Neiguan on acute myocardial ischemia rats with nonspecific stress.Methods 36 SD rats were randomly divided into control (K),model (M),moxibustion groups of 1 day (A),2 days(B),3 days(C)and 5 days(D).Acute myocardial ischemia model was prepared by ligating the left anterior descending coronary artery.Rats in K group had no any processing.Rats in M group had no intervention.Rats in wheat moxibustion groups were treated once a day,6 strong/times,continuous moxibustion respectively 1 d,2 d,3 d and 5 d,and acute myocardial ischemia model was prepared at the end of moxibustion.Blood serum was prepared before and after making model each group and separated the heart for TTC staining.The content of cortisol (Cort)was determined by using enzyme-linked immunosorbent,the immune suppression method was adopted to detect the contents of CK-MB,ELISA was used to detect the content of cTnT.Results Compared with the K group,Cort levels of wheat moxibustion groups before building were increased (P<0.01);Before building,serum CK-MB,cTnT of group M and group A were increased,but there was no statistical significance (P>0.05).Before building,CK-MB and cTnT of B,C,D group were increased(P<0.05).Compared with K group,the Cort level and serum CK-MB were increased after building (P<0.01),cTnT were increased of model group and wheat moxibustion groups (P<0.05).After building,compared with the M group,the Cort levels of wheat moxibustion groups were increased (P<0.05);serum CK-MB,cTnT were increased I Group A,but there were no statistical significances (P>0.05);CK-MB,cTnT were increased in B,C,D group (P<0.05).Compared with M group,the myocardial ischemia area ratio of A and B group were decreased significantly (P<0.05);myocardial ischemia area ratio of E group was significantly increased compared with group B (P<0.05).Conclusions Wheat-moxibustion pretreatment on Neiguan is effective on prevention and treatment of acute myocardial ischemia and its mechanism is related to the degree of non-specific stress response.

Wheat-moxibustion;Myocardial ischemia;Stress;Myocardial preservation

国家自然科学基金项目(No.81674063)；江苏省普通高校科研创新计划项目(No.KYLX16-1152)

顾一煌(1965-)，男，教授，硕士生导师，主要从事针灸推拿学研究。

白 桦(1992-)，女，在读硕士，主要从事中医养生学研究。

R245.8

A

1005-9202(2016)23-5783-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.006