苗药对三叉神经痛大鼠三叉神经节p-ERK1/2表达的影响

吴远华 司凯隆

(贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550002)



苗药对三叉神经痛大鼠三叉神经节p-ERK1/2表达的影响

吴远华 司凯隆1

(贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550002)

目的 探讨三叉神经痛的发病机制及苗药血飞荜茇定痛汤治疗该症的应用价值。方法 采用祛风清热通络法，运用慢性缩窄环法制作三叉神经痛模型大鼠，造模成功后进行模型动物三叉神经节离体培养，对培养后的神经节进行WEIL髓鞘染色、HE染色与甲苯胺蓝染液染色和常规电镜制片。采用免疫组化检测p-ERK1/2的表达。结果 光电镜结果显示：阴性和低剂量组神经纤维变性，轴突不规则或消失；中、高剂量组及空白组神经纤维未见明显变化。卡马西平组三叉神经节p-ERK1/2表达量最低，其余造模组均高于卡马西平组，依次为：中剂量组<高剂量组<阴性对照组<低剂量组<空白组；苗药对卡马西平组三叉神经节p-ERK1/2表达的抑制作用最强，高、中剂量组明显低于空白组，高、中剂量组p-ERK1/2表达量下调(P<0.05)。结论 一定剂量的苗药可能缓解三叉神经痛，可能是通过抑制ERK的激活而实现的。

三叉神经痛；三叉神经节；祛风清热通络法

原发性三叉神经痛是一种临床上常见的疾病，其特点是面部发作性的剧烈疼痛，发病率达0.4%～0.5%〔1〕，但其发病机制尚不完全明确。中医认为：肝风内动，肝胃火盛，风火相燔，窜逆于面，瘀阻脉络，不通则痛，肾功能失常亦通过影响肝胃而致病，故在病机分析中肝胃为主病脏腑。苗药有祛风清热通络之功效，常用来祛瘀止痛等。根据中医肝胃藏象及经络理论，在苗药血飞荜茇定痛汤穴临床运用疗效满意的基础上，拟以祛风清热通络法为核心治法对三叉神经痛模型大鼠展开实验研究，探讨苗药血飞荜茇定痛汤治疗的作用机制和靶点。

1 材料与方法

1.1 实验药物 苗药血飞荜茇定痛汤方药制剂由贵阳中医学院第一附属医院中药制剂室提供，配方组成：见血飞(飞龙掌血)、苕叶细辛、白芷、全蝎，蜈蚣、大血藤、川芎、赤芍、白芍、炙甘草。

1.2 实验动物的选择、分组及给药方法 成年雄性健康SD大鼠，体质量(250±20)g。在术前对疼痛阈值(作为基础痛阈)进行测定，并实施左侧眶下神经-慢性缩窄损伤(ION-CCI)环扎术。术后14 d，观察大鼠是否出现痛觉超敏现象，并纳入出现该现象的大鼠。纳入大鼠通过随机数字表法分组：空白组：自然环境、普通饲料饲养，以生理盐水灌胃，1次/d，共14 d；阴性组：测定术前疼痛阈值(作为基础痛阈)后，进行左侧眶下神经(ION-CC)环扎术制作三叉神经痛大鼠模型，通过对环扎线标记比较其松紧度及手术线的选择等优化选择造模方法的指标，选出最优造模方案。造模成功后以生理盐水灌胃，1次/d，共14 d；治疗组：造模成功后给予苗药血飞荜茇定痛汤灌胃，高、中、低剂量分别按成人临床用药剂量的20倍、10倍、5倍计算，灌胃1次/d，共14 d；阳性对照药卡马西平组：造模成功后给予卡马西平治疗，相当于成人剂量的10倍，灌胃1次/d，共14 d。

1.3 超微结构与病理形态学观察 术后14 d，处死各组大鼠，将大鼠三叉神经节、眶下神经组织取出后，选择10%甲醛固定，石蜡包埋后切片，分别进行WEIL髓鞘染色、苏木素-伊红(HE)染色与甲苯胺蓝染液染色(着色后的节细胞蓝染)。之后常规电镜制片，进行观察。

1.4 p-ERK1/2表达的检测 各组大鼠完成实验后，在规定时间内通过1%戊巴比妥钠行腹腔麻醉(40 mg/kg体重)。麻醉后予以开胸，将右心耳剪开，并从左心室插管至主动脉，选择150 ml 0.9%氯化钠注射液(室温)快速灌注后，再以含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸钠盐缓冲液(PBS)500 ml(4℃)灌注固定2 h。将大鼠脑组织取出，置入含300 g/L蔗糖的0.1 mol/L PBS内，在4℃冰箱中放置，直到沉底。冠状冰冻切片，切片厚度为20 μm。严格按照说明书要求进行p-ERK免疫组织化学染色。通过IPP 6.0图像分析系统对表达进行检测，并对三叉神经节(10×20倍)视野中p-ERK阳性细胞区域的积分光密度值总和(Dsum)予以测定，计算平均光密度值。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 光镜观察 低剂量组与阴性组大鼠神经纤维变性增粗、肿胀，轴突不规则或消失，未见神经节细胞，半髓鞘增厚，疏松、瓦解或呈节段性脱髓鞘，纤维松解断，神经周围小动脉管壁增厚，管腔狭窄，大部分病例神经周围纤维组织增生。中、高剂量组及空白组神经纤维未见明显变化。见图1。

2.2 电镜观察 阴性和低剂量组神经纤维髓鞘增生、结构紊乱，轴突变细或消失；线粒体肿胀，数量增多，位于轴突的边缘。中、高剂量组及空白组神经纤维髓鞘及线粒体未见明显变化。见图2。

图1 各组光镜检查结果(HE染色)

图2 各组电镜检查结果

2.3 三叉神经节中p-ERK1/2表达 卡马西平组三叉神经节p-ERK1/2表达量最低(0.271 2±0.036 3)，其余造模组均高于卡马西平组，依次为：中剂量组(0.284 8±0.019 3)<高剂量组(0.289 7±0.032 9)<阴性对照组(0.317 2±0.031 3)<低剂量组(0.337 7±0.032 5)<空白组(0.344 8±0.047 5)；苗药对卡马西平组三叉神经节p-ERK1/2表达的抑制作用最强，高、中剂量组明显低于空白组(P<0.05)。

3 讨 论

祖国医学认为，面痛为肝胆风火或阳明燥热，久病入络，瘀血阻滞经脉所致。面部为阳明经(胃经)及少阳经(胆经)所过之处。根据经络理论，胃与大肠均属阳明、胆为少阳，足厥阴肝经与胆、胃二经经气相通。《灵枢·经脉》曰：“肝足厥阴之脉…，挟胃，属肝、络胆。本病呈发作性，突发突止，符合肝风的特性，肝胆火盛，肝胃郁热或肝肾阴虚，虚风内动，挟胃胆二经之气血随之升腾上逆，上扰面之清窍，流窜面之经络，引动络之伏邪而发为面痛。故该病与肝胃关系密切，治疗以祛风清热通络法为核心，以血飞荜茇定痛汤平肝熄风，清胃泻热，祛瘀止痛。

原发性三叉神经痛属神经系统常见病，主要表现为三叉神经分布区不同程度的针刺样、撕裂样及电击样疼痛，持续时间十几秒到数分钟不等，呈阵发性，疼痛剧烈且急骤，严重者甚至会对咀嚼及语言功能造成影响，复发率高，病程迁延难愈。卡马西平是目前治疗该症的首选药物，但此药物可引起多种中枢神经系统相关的副作用，患者难以耐受，治疗依从性较差。

对于原发性三叉神经痛的病因一直存在争议，有研究发现三叉神经痛的半月神经节和周围支有明显的髓鞘增生与退行性变〔2〕。与本研究的观察结果一致，提示三叉神经的脱髓鞘改变是三叉神经痛的主要病理改变和主要病因，髓鞘变性，可使神经节部分或全部脱髓鞘，使神经轴突暴露，当这些暴露的神经轴突相互接触时，可产生触电样的阵发性疼痛。当脱髓鞘的轴突与一个失去了雪旺细胞并且变性的无髓鞘轴突相接触时，同样可发生这样的情况。这种短路一直要持续到变性的神经轴突消失为止，疼痛才能缓解。当产生其他脱髓鞘神经轴突变性时，疼痛又可再度发生而使病情加剧。

有研究指出：白芷中的总香豆素类成分具有明显的镇痛作用〔3〕；血藤中的地血香成分具有祛风除湿，散瘀活络等作用〔4〕；赤芍与其他中药联合使用，具有行气止痛、活血定痛等功效，起到保护神经细胞的作用〔5〕；而见血飞具有明显的镇痛效果在文献中也有提到〔6〕；在现代药理研究中提到川芎具有扩张血管，加速血流，开放毛细血管网，改善微循环的作用〔7〕。用祛风清热通络法治疗三叉神经痛，其疗效好，可以缓解三叉神经痛患者的疼痛症状。

真核细胞内存在广泛的丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路，对细胞的分化、增殖以及细胞凋亡抑制等功能具有促进作用，其主要由3条通路组成，分别为P38信号通路、ERK1/2信号通路、JNK信号通路〔8〕。而在细胞信号转导网络中处于枢纽地位的ERK1/2通路会受到神经递质、激素、血管肽类及炎性因子等细胞外信号分子刺激，并通过G-蛋白和细胞内一系列蛋白激酶级联活化反应及跨膜信号转导，使膜受体出现一系列生物学效应，如表达调变、细胞生长、分化、增殖和移动等〔9，10〕；细胞外信号相关蛋白激酶(ERK)是信号通路多个上游区调节器的最后共同效应器，是将信号从膜表面受体转导到细胞核的关键。因此只要阻滞了ERK的激活，就有可能阻止胞外信号向胞内的转导，从而影响中枢致敏和突触的可塑性〔11〕。有研究指出，ERK1/2在三叉神经脊束核痛觉信号的传导和调节中起重要作用〔12〕。p-ERK是初级传入感受伤害神经元兴奋的重要解剖学标志〔13〕。因此，监测p-ERK1/2的表达量可衡量痛觉信号传导。

本研究结果推测，苗药中某些成分使p-ERK1/2表达下调，影响细胞信号的传导，负责疼痛信号传导的蛋白或酶不能接受信号而不能发生后续的酶联反应，从而减少了疼痛的表现。相类似的研究如Chen等〔14〕发现，在周围神经CCI术后引起的神经病理性痛的动物模型中，鞘内给予ERK抑制剂PD98059后可以减轻大鼠神经病理性痛的表现，说明在产生痛觉敏化的过程中脊髓背角ERK的激活起了关键作用。

另外，苗药中含有多种止痛镇痛的成分。在多种成分的共同镇痛作用下，使起作用的有效分子的含量增高，而细胞外信号分子含量相对减少，信号不能从胞内传到胞外，跨膜分子的级联反应受到影响，ERK激活受阻，进而影响其合成，疼痛信号传导不能正常进行。

1 秦泗佳，王 福.原发性三叉神经痛发病机制的研究进展〔J〕.中华神经外科杂志，2012；28(12)：1293-5.

2 Liu Y，Li J，Butzkueven H，etal.Microstructural abnormalities in the trigeminal nerves of patients with trigeminal neuralgia revealed by multiplediffusion metrics〔J〕.Eur J Radiol，2013；82(5)：783-6.

3 高小坤.白芷挥发油镇痛、镇静作用实验研究〔J〕.现代中西医结合杂志，2013；22(35)：3880-2，3888.

4 陈茹茹，刘正君，唐俊峰，等.大血藤化学成分提取方法和药理作用的研究进展〔J〕.海峡药学，2014；26(5)：3-5.

5 陆小华，马 骁，王 建，等.赤芍的化学成分和药理作用研究进展〔J〕.中草药，2015，46(4)：595-602.

6 云雪林.苗药飞龙掌血的药理作用和临床应用研究进展〔J〕.中国民族医药杂志，2012，18(7)：58-60.

7 王永忠，童树洪.川芎的传统用法与现代药理研究〔J〕.中国药业，2012；21(7)：95-6.

8 Chueh FS，Chen YY，Huang AC，etal.Bufalin-inhibited migration and invasion in human osteosarcoma U-2 OS cells is carried out by suppression of the matrix metalloproteinase-2，ERK，and JNK Signaling Pathways〔J〕.Environ Toxicol，2014；29(1/2)：21-9.

9 Woolley MJ，Watkins HA，Taddese B,etal.The role of ECL2 in CGRP receptor activation：a combined modelling and experimental approach〔J〕.J R Soc Interface，2013；10(88)：20130589.

10 Hamel LP，Nicole MC，Duplessis S，etal.Mitogen-activated protein kinase signaling in plant-interacting fungi：distinct messages from conserved messengers.〔J〕.Plant Cell，2012；24(4)：1327-51.

11 汪挺舰，杨治权.三叉神经痛的动物模型研究进展〔J〕.中华实验外科杂志，2014；31(4)：925-6.

12 江新泉，孙利利，马 娜，等.偏头痛模型大鼠三叉神经脊束核磷酸化ERK1/2水平变化〔J〕.中华行为医学与脑科学杂志，2014；23(9)：781-3.

13 Park MH，Galan HL，Arroyo JA,etal.Effect of hypoxia on endothelial nitric oxide synthase，NO production，intracellular survival signaling (p-ERK1/2 and p-AKT)and apoptosis in human term trophoblast〔J〕.Am J Reprod Immunol，2011；65(4)：407-14.

14 Chen XY，Cai HZ，Wang XY，etal.Application of the ERK signaling pathway inhibitor PD98059 in long-term in vivo experiments〔J〕.Genet Mol Res，2015；14(4)：18325-33.

〔2016-02-17修回〕

(编辑 袁左鸣)

贵州省科学技术基金项目：黔科合J字〔2011〕2303号

1 贵阳中医学院

司凯隆(1989-)，男，住院医师，主要从事中西医结合神经性疼痛的研究。

吴远华(1976-)，男，硕士，副主任医师，主要从事中西医结合治疗脑血管病研究。

R745.1+1

A

1005-9202(2016)23-5824-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.022