基质相互作用分子1在红藻氨酸致癫大鼠的表达及依达拉奉的干预作用

2016-12-23臧兆萍李志茹刘忠锦杨晓华高巍巍齐宝奎

中国老年学杂志 2016年23期

关键词：钙通道氨酸缓冲液

臧兆萍李志茹刘忠锦杨晓华高巍巍齐宝奎

(齐齐哈尔医学院第一附属医院神经内科，黑龙江齐齐哈尔 161041)

基质相互作用分子1在红藻氨酸致癫大鼠的表达及依达拉奉的干预作用

臧兆萍李志茹刘忠锦杨晓华高巍巍齐宝奎

(齐齐哈尔医学院第一附属医院神经内科，黑龙江齐齐哈尔 161041)

目的观察基质相互作用分子(STIM)1在红藻氨酸(KA)致癫大鼠的表达及依达拉奉的干预作用。方法 50只雄性Wistar大鼠被随机分为5组，每组10只。正常组、磷酸盐缓冲液(PBS)组、癫痫组，治疗组1(地西泮治疗组)，治疗组2(地西泮+依达拉奉治疗组)。癫痫组在大鼠右侧海马以每公斤体重注射 1.5 μg/μl KA，PBS组采取同样的方法在相同部位注入等量PBS，治疗组1在癫痫模型成立后给予10 mg/kg地西泮终止癫痫，治疗组2在治疗组1的基础上1 h后再给予依达拉奉30 mg，12 h一次，正常组不注射任何药物。结果用激光共聚焦显微镜观察，癫痫组STIM1的表达密度显著高于PBS组及正常组(P<0.05)，治疗组较正常组、PBS组及癫痫组表达增高(P<0.05)。治疗组1较治疗组2表达增高(P<0.05)。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酯胺凝胶(SDS-PAGE)分析显示STIM1的相对分子质量分别46 kD，并且发现其在癫痫组的表达较正常组及PBS组增加，治疗组较癫痫组相比降低，所得结果与激光共聚焦的结果相一致(P<0.05)。结论 STIM1表达增加对大鼠癫痫后海马的神经元损伤具有细胞保护作用。

癫痫；基质相互作用分子(STIM)1；红藻氨酸

癫痫是一种神经元发作性异常放电所引起的临床症候群，病因复杂，发病机制尚未阐明。研究发现癫痫患者 30%～70%存在认知功能障碍〔1，2〕。癫痫在《黄帝内经》中记载，曰：“诸暴强直，皆属于风……诸风掉眩，皆属于肝”，中医对于癫痫的治疗多以“从肝论治”为出发点，但因受中药成分复杂的影响，所以中药治疗极少。依达拉奉可清除自由基、抑制兴奋性神经递质谷氨酸的释放。钙释放激活的钙(CRAC)通道是钙通道中的一种位于细胞质膜上的慢钙通道，基质相互作用分子(STIM)1是CRAC通道关键蛋白中的一个，介导CRAC通道的组成和激活。本实验研究STIM1在红藻氨酸(KA)大鼠海马中的表达变化及依达拉奉治疗后的表达变化，旨在探讨其在颞叶癫痫发生及治疗中的可能作用。

1 资料与方法

1.1 材料健康成年雄性清洁级Wistar大鼠50只(体重200～250 g)，环境温度适宜，动物实验过程遵守中华人民共和国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》的规定。

1.2 癫痫动物模型的建立将Wistar大鼠用10%水合氯醛1 ml(0.3～0.4 ml/kg体重)麻醉后固定，备皮，切开，剥离，按大鼠脑立体定向图谱，以前囟为靶点定位CA3〔坐标：X=2.5 mm(右)，Y=3.0 mm，Z=3.5 mm〕钻孔，在动物清醒和无菌的条件下，用1 μl微量注射器注入以磷酸盐缓冲液(PBS)配制的浓度为1.5 μg/μl KA 1 μl，注药持续10～15 min，留针5 min。根据KA诱发鼠的行为学改变判定癫痫鼠模型的建立。PBS组于相同部位等时注入等量的PBS。以Racine等〔3〕行为学标准判定癫痫模型，治疗组1在癫痫模型成立后给予10 mg地西泮终止癫痫，治疗组2在治疗组1的基础上1 h后再给予依达拉奉30 mg,12 h一次，在正常组不注射任何药物。

1.3 标本的制备标本固定、包埋、切片、脱蜡、抗原修复、封闭，兔抗鼠STIM1抗体单克隆抗体(1∶100)4℃孵育过夜，第2天切片室温复温1 h，PBS漂洗，滴加山羊抗兔异硫氰酸荧光素(FITC)标记荧光二抗(浓度1∶50)，2.5 μg/ml碘化丙啶(PI)染色20 min后漂洗水化封片。从加荧光二抗开始的双重标记实验过程均需避光操作。双标法参照Bernardini等〔4〕，并根据本实验的样品要求进行了改进。

1.4 共聚焦激光扫描显微镜检测与数据分析所用仪器为奥林巴斯LSM 510 META共聚焦激光扫描生物显微镜，能同时激发波长为488 nm和514 nm可见光激光光源，发射波长分别为516 nm与617 nm，两者无交叉重叠区域，这种区分是进行双重标记和观察的前提。每张切片随机取10个视野，连续扫描10个层面。将数字化图像存储进行图像数据分析。

1.5 蛋白质印迹分析及样品处理提取细胞总蛋白，酶标仪测总蛋白含量，按照样品与5×上样缓冲液为4∶1的比例加入5×上样缓冲液，煮沸5 min使蛋白变性。步骤为：制备12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，取60 μg总蛋白上样，电泳45 min；室温、恒压220 V条件下，湿转移法转膜40 min〔聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，Hybond，America〕。磷酸盐缓冲液(PBS)配制的5%脱脂奶粉溶液用作封闭液，37℃封闭2 h；STIM1，抗体(1∶50)4℃孵育过夜；吐温-20的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST)漂洗3次，10 min/次；加入辣根过氧化物酶-抗兔IgG(1∶8 000)室温摇床中孵育2 h，TBST 洗3次，每次5～10 min；电化学发光(ECL)反应30 min后，暗室中X线片曝光；室温显影、定影。用GIS凝胶成像系统对胶片进行薄层密度扫描，记录相应条带的透射光积分光密度(IOD)值反映蛋白含量。β-actin 为内参。

1.6 统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结果

正常组(1～3)，PBS组(4～6)，癫痫组(7～9)，治疗组1(10～12)，治疗组2(13～15)图1 免疫荧光双染法测STIM1在各组海马的表达(×200)

2.1 癫痫大鼠海马CA3区蛋白的表达当检测通道为488 nm时，仅显示被染成绿色荧光的光斑(见图1中1、4、7、10、13)，而当检测通道为514 nm时，仅显示被染成红色的核酸(见图1中2、5、8、11、14)，这样更加清楚地显示了细胞核的轮廓，当细胞核PI标记的核酸红色而与细胞外FITC标记的荧光二抗绿色叠加时，更能突显细胞质中所观测蛋白的表达(见图1中3、6、9、12、15)。在CA3区，STIM1癫痫组表达密度(5.08±0.10)高于正常组(1.01±0.06)及PBS组(1.07±0.01)，治疗组低于癫痫组，治疗组1(3.11±0.18)显著低于治疗组2(3.70±0.28)(P<0.05)。

2.2 免疫印迹法癫痫大鼠海马CA3区蛋白的表达 STIM1的相对分子质量分别46 kD，并且发现STIM1表达的变化与癫痫组高于正常组相一致。见图2。

图2 STIM1在癫痫大鼠海马CA3区的表达

3 讨论

KA致癫模型已经在国内外得到广泛认可，KA是人工提取的一种谷氨酸类似物，具有很强的神经毒性作用，它可与脑内神经元突触后膜上的非N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体结合，目前认为兴奋性氨基酸的堆积和海马神经元兴奋性氨基酸受体的上调是KA诱导痫性发作的主要分子机制〔5〕。海马 CA3 区神经元死亡、胶质细胞增生和苔状纤维发芽是红藻氨酸致颞叶癫痫模型一个显著的病理特点，这样的病理改变同人类颞叶癫痫的病理改变与海马硬化相一致〔6〕。

研究表明钙通道参与癫痫形成〔7～9〕，钙通道异常引起Ca2+过度内流，大量神经元同步过度放电，致其发作。在癫痫患者中，钙通道异常，致Ca2+过度内流，神经元异常放电，本实验采用地西泮及依达拉奉的联合治疗，致STIM1的表达改变，从而干预CRAC通道的激活，从而对异常放电的神经元起到保护作用。通过其表达增加从而对癫痫后神经元的过度放电的损伤具有保护作用。地西泮组联合依达拉奉治疗STIM1表达增加更显著，从而脑保护作用更显著，其可能的作用机制是依达拉奉可降低谷氨酸的兴奋性，而二者的联合使用是序贯使用，不是混合应用，故不考虑二者混合应用会对大鼠造成不良反应，实验也证实二者的联合应用不受此影。依达拉奉通过抑制脂质过氧化起到保护作用。依达拉奉的分子量较小，约60%可以透过血脑屏障，能够在脑内到达有效治疗浓度。静脉给药能够将大脑中的羟自由基(具有高度细胞毒性)有效清除〔10，11〕。依达拉奉注射液作为一种新型的自由基清除剂，已在神经科广泛使用〔12〕。依达拉奉注射液可通过清除自由基、抑制兴奋性神经递质谷氨酸的释放、激活细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、上调脑源性神经营养因子(BDNF)和Bcl-2 蛋白表达、下调海马胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和白细胞介素(IL)-1β表达、下调 C-Jun N 端激酶(JNK)表达从而减少神经元凋亡，减轻脑损害〔13～17〕。 Kamida 等〔10〕研究发现依达拉奉可通过降低诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达而减少癫痫持续状态后大鼠的海马神经细胞凋亡状况，从而起到神经保护作用。本实验证实依达拉奉对癫痫大鼠的神经元损伤具有保护作用，但其具体保护机制仍有待进一步研究。

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〔2015-03-19修回〕

(编辑苑云杰)

黑龙江省自然科学基金资助项目(No.H201498)

齐宝奎(1969-)，男，副主任医师，主要从事脑血管病与癫痫研究。

臧兆萍(1979-)，女，主治医师，硕士，主要从事癫痫的发病机制及治疗研究。