雪莲果叶提取物的抗氧化活性研究

袁晓艳，张 峰

(遵义医学院 药学院分析化学教研室，贵州 遵义 563099)



基础医学研究

雪莲果叶提取物的抗氧化活性研究

袁晓艳，张 峰

(遵义医学院 药学院分析化学教研室，贵州 遵义 563099)

目的 对雪莲果叶进行提取分离，并对提取物及萃取各部位进行抗氧化活性测试，将雪莲果叶发展成为抗氧化植物源。方法 以70%的乙醇溶剂对雪莲果叶进行提取，提取液减压浓缩后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行分步萃取，获得雪莲果叶总提取物及石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水留层5个极性不同的部位。分别测定5个部位的总酚酸含量、DPPH自由基消除活性、ABTS+自由基消除活性、羟基自由基消除活性。结果 雪莲果叶乙酸乙酯部位的总酚酸含量最高，达(29.93±0.31)mg/g，对自由基清除活性最强，清除DPPH、ABTS+及羟基自由基的SC50值分别为(37.96±0.43、29.46±1.05、1.67±0.03)μg/mL，活性高于(P<0.05)常用人工合成抗氧化试剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT)。结论 雪莲果叶具有抗氧化活性的成分主要集中于乙酸乙酯部分，酚酸是其具有抗氧化活性的主要原因。

雪莲果；叶片；抗氧化活性；提取；分离

雪莲果(Smallanthussonchifolius)，为菊科(Asteraceae)向日葵属(Helianthus)多年生草本植物，又称雪莲薯、亚龙果、亚贡，原产于南美的安第斯山区，后引入日本和欧洲一些国家，当前在我国海南、台湾、云南、贵州、江苏、福建、湖南、湖北等地少量种植[1]。雪莲果是传统的根茎食品，至今已有500年的食用史，被认为是可缓解糖尿病、肠道功能紊乱等多种慢性疾病的药食两用植物之一，民间用雪莲果叶加工成茶，冲泡饮用，有降血糖、预防动脉粥样硬化的功效[2-3]。国内外对雪莲果最重视的仍然是其块根的食用及保健价值，但在其他领域的应用及地上部分资源的开发和利用研究较少[4]。

雪莲果叶中含有大量酚酸类物质，含量超过3.6%，主要是绿原酸、咖啡酸和阿魏酸等，该类化合物具有比抗坏血酸、生育酚更强的自由基清除效果，同时还具有抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降血压等多种药理活性[5]。酚酸类化合物在植物界广泛存在，但含量高的植物不多，主要在金银花、杜仲等药用植物中含量较高[6-7]。本文在抗氧化活性指导下对雪莲果叶进行研究，分析雪莲果叶成分与抗氧化活性之间的关系，为将雪莲果叶进一步开发成为抗氧化植物源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 电子天平EL303(梅特勒-托利多公司)；电子调温电热套98-1-B型(天津泰斯特公司)；旋转蒸发器RE-2000(上海亚荣生化仪器厂)；TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 试剂 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)；无水碳酸钠(重庆茂业化学试剂有限公司)、二水钼酸钠(广东光华化学厂有限公司)、钨酸钠、硫酸锂、磷酸二氢钠(天津市致远化学试剂有限公司)、磷酸、浓盐酸、甲醇(成都市科龙化工试剂厂)、30%过氧化氢(重庆江川化工有限公司)、七水合硫酸亚铁(广州化学试剂厂)、磷酸氢二钠(成都市科龙化工试剂厂)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl， DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS]、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT)、邻二氮菲、没食子酸(阿拉丁试剂)。

1.3 供试材料 雪莲果干燥叶片2013年11月采摘于贵州省安龙县，由遵义医学院生药学教研室张玉金博士鉴定为菊科向日葵属雪莲果的干燥叶子。

1.4 方法

1.4.1 提取及分离 精密称取干燥雪莲果叶200 g，捣碎后，按料液比(v/m)15∶1加70%乙醇3 L浸泡后回流提取3次，每次2 h，过滤后合并提取液，取1/4提取液减压浓缩至干，得粗提物(crude extraction，CE)25.849 8 g，另外3/4提取液减压浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按照1∶1的比例进行，各萃取3次，合并萃取液，将各萃取液分别浓缩至浸膏状，分别得石油醚萃取物(petroleum ether fraction，PE fra.)5.475 4 g，乙酸乙酯萃取物(ethyl acetate fraction， EA fra.)2.576 6 g，正丁醇萃取物(n-butanol fraction，NB fra.)3.930 9 g，水留层部位(Water fraction，WT fra.)14.471 1 g。

1.4.2 总酚酸含量测定 雪莲果叶粗提物及各萃取部位总酚酸含量以没食子酸作为标志物计算，采用菲林(Folin-Ciocalteu)法测定，菲林试剂采用文献[8]方法制备。精密称取没食子酸6 mg，甲醇溶解定容于50 mL容量瓶，配制成0.12 mg/mL的标准储备液。准确量取没食子酸标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置于10 mL容量瓶中(不足1.2 mL用甲醇补足)，各加6 mL水，0.5 mL菲林试剂，充分摇匀，1 min后加20%碳酸钠溶液1.5 mL混合定容。在75 ℃下反应10 min，于772 nm波长下测吸光度，建立没食子酸标准曲线。

雪莲果叶粗提物及各萃取部位各取100 mg以甲醇溶解定容于50 mL的容量瓶中，各取0.5 mL 置于10 mL容量瓶中，各加0.7 mL甲醇补足1.2 mL与20%碳酸钠溶液1.5 mL和0.5 mL菲林试剂混合，在75 ℃下反应10 min，于772 nm波长下测定吸光度，总酚酸含量以mg没食子酸相当于g待测样品表示，上述步骤平行3次。

1.4.3 DPPH自由基清除实验 DPPH自由基清除活性实验根据Turkoglu等[9]方法进行测定，2.0 mL DPPH(0.1 mmol/L)自由基乙醇溶液与2.0 mL不同浓度待测样品反应。10 min后在516 nm波长下测吸光度，BHT作为阳性对照，测定方法同上，平行测定3次。DPPH自由基清除活性根据清除率公式计算:

清除率(%)=[(A0-As)/A0]×100

(1)

其中A0为空白溶液的吸光度，As是待测液的吸光度。

1.4.4 ABTS+自由基清除活性 根据Re等[10]描述的方法进行测定，首先精密称取0.013 2 g过硫酸钠与0.076 8 g ABTS盐混合，在20 mL去离子水中反应产生ABTS+自由基，将该储备液室温放于暗处14～16 h。使用前，将ABTS+储备液用PBS(4 mmol/L，pH=7.4)缓冲液稀释获得734 nm波长下吸光度为0.700±0.004的ABTS+溶液。取0.1 mL不同浓度待测样品与1.9 mL ABTS+溶液混合，反应5 min后，在734 nm波长下测吸光度，BHT作为阳性对照。ABTS+自由基清除活性公式同DPPH自由基清除活性公式，平行测定3次。

1.4.5 羟基自由基清除活性 羟基自由基清除活性采用Yu等[11]所述方法进行测定。首先配制2.5 mmol/L PBS(pH=7.4)缓冲液，3 mmol/L硫酸亚铁溶液，3 mmol/L邻二氮菲(1,10-phenanthroline)溶液及1% H2O2。取2.0 mL PBS缓冲液与0.5 mL硫酸亚铁(3 mmol/L)、0.5 mL邻二氮菲(3 mmol/L)、0.5 mL水和0.5 mL乙醇混合，所测吸光度为A0。取2.0 mL PBS缓冲液与0.5 mL硫酸亚铁(3 mmol/L)、0.5 mL邻二氮菲(3 mmol/L)、1% H2O2溶液0.5 mL和0.5 mL乙醇混合，所测吸光度为A1。取2.0 mL PBS缓冲液与0.5 mL硫酸亚铁(3 mmol/L)、0.5 mL邻二氮菲(3 mmol/L)、1% H2O2溶液0.5 mL和0.5 mL不同浓度样品混合，所测吸光度为As。各组混合溶液都在560 nm波长下测吸光度，BHT作阳性对照，平行测定3次，羟基自由基清除活性公式：

清除率(%)=[(As-A1)/(A0-A1)]×100

(2)

2 结果

2.1 DPPH自由基消除能力 不同浓度雪莲果叶粗提物和各萃取部位DPPH自由基清除率见图1。以SPSS 19.0回归分析计算各测试样品的半清除浓度SC50，雪莲果叶粗提物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水部位及BHT清除自由基的SC50值分别为：(74.96±3.30、232.09±3.21、37.96±0.43、55.55±2.17、136.67±2.87和42.51±1.06)μg/mL。SC50值越小说明对自由基活性清除越强。结果表明乙酸乙酯部分对DPPH自由基清除能力最强。对DPPH自由基清除活性顺序为：乙酸乙酯萃取物>BHT>正丁醇萃取物>粗提物>水部位>石油醚萃取物(P<0.05)，与图1各样品所表现的清除能力一致。

WT fra.：水部位；NB fra.：正丁醇萃取物；EA fra.：乙酸乙酯萃取物；PE fra.：石油醚萃取物；CE：雪莲果叶粗提物；BHT：人工合成抗氧化试剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。 图1 雪莲果叶提取物及各萃取部位DPPH自由基清除活性结果

2.2 ABTS+自由基清除能力 不同浓度雪莲果叶粗提物和各萃取部位ABTS+自由基清除率见图2。雪莲果叶粗提物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水部位和BHT清除自由基的SC50值依次为：(51.46±0.88、69.12±1.46、29.46±1.05、45.42±1.36、175.39±2.87和33.83±1.03)μg/mL，各部分对ABTS+自由基清除活性顺序为：乙酸乙酯萃取物>BHT>正丁醇萃取物>粗提物>石油醚萃取物>水部位(P<0.05)。

WT fra.：水部位；NB fra.：正丁醇萃取物；EA fra.：乙酸乙酯萃取物；PE fra.：石油醚萃取物；CE：雪莲果叶粗提物；BHT：人工合成抗氧化试剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。 图2 雪莲果叶提取物及各萃取部位ABTS+自由基清除活性结果

2.3 羟基自由基清除能力 羟基自由基是目前已知的活性自由基中对生物体危害最大、毒性最强的一种自由基。因此，实验同时也测定了雪莲果叶粗提物和萃取各部分对羟基自由基清除的能力，结果见图3，与DPPH和ABTS+自由基清除实验结果相似，随着样品浓度的升高清除羟基自由基活性能力也在一定范围内增强。经计算，雪莲果叶粗提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、粗提物、水部位和BHT的羟基自由基清除SC50值依次为：(7.48±0.11、681.32±4.56、1.67±0.03、3.32±0.05、6.51±0.08、5.55±0.04和5.31±0.09)μg/mL。SC50的值越小羟基自由基活性清除能力越强，活性顺序为：乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>BHT>水部位>粗提物>石油醚萃取物(P<0.05)，与图3表现出相同清除自由基的趋势。

WT fra.：水部位；NB fra.：正丁醇萃取物；EA fra.：乙酸乙酯萃取物；PE fra.：石油醚萃取物；CE：雪莲果叶粗提物；BHT：人工合成抗氧化试剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。 图3 雪莲果叶提取物及各萃取部位羟基自由基清除活性结果

2.4 总酚酸含量(Total phenolic content，TPC) 植物提取物的抗氧化活性大小与提取物中各部分的总酚酸含量有关[12]。因此，对雪莲果叶的粗提物和各萃取部分测定总酚酸含量有重要意义。以没食子酸浓度为横坐标(X)，以没食子酸的吸光度A为纵坐标(Y)，没食子酸的校正曲线公式为：Y=52.388X+0.033 6(r=0.997 2)。在(0.002 4～0.014 4)mg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系。同时根据校正曲线公式计算出雪莲果叶粗提物和各部分的总酚酸含量(见表1)，乙酸乙酯部分总酚酸含量最高，达到(29.9±0.31)mg/g，然后是正丁醇、粗提物、石油醚和水层。总酚酸含量与自由基清除活性大致相同。

表1 莲果叶雪莲果叶提取物及各萃取部位总酚酸含量

样品粗提物石油醚萃取物乙酸乙酯萃取物正丁醇萃取物水部位总酚酸(mg/g)20．20±0．308．81±0．0729．93±0．3121．91±0．167．56±0．16

3 讨论

人体新陈代谢失衡会导致自由基过量，很多疾病，包括衰老，癌症，心血管疾病，神经退化性疾病以及各种炎症都与自由基过量相关，抗氧化剂可以直接清除自由基或提高内源性抗氧化物水平，研究开发天然高效毒副作用小的抗氧化剂，已经成为预防及治疗某些疾病的途径之一。

本研究通过对雪莲果叶的提取和分离，测定雪莲果叶提取物及石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取部位及水部位对DPPH、ABTS+及羟基自由基的清除活性，发现雪莲果叶提取物及各萃取部分均存在自由基清除活性，其中乙酸乙酯萃取物具有最高的清除自由基活性，清除 DPPH、ABTS+及羟基自由基活性的SC50值分别为(37.96±0.43、29.46±1.05、1.67±0.03)μg/mL，活性远高于常用人工合成抗氧化剂。对雪莲果叶提取物及各极性不同萃取部位的总酚酸含量测定结果表明乙酸乙酯萃取物总酚酸含量最高，达(29.93±0.3)mg/g，其次为正丁醇萃取部位，清除自由基活性及总酚酸含量结果表明，雪莲果叶中的酚酸是其具有高抗氧化活性的主要原因。乙酸乙酯萃取部位及正丁醇萃取部位是进一步进行分离制备雪莲果叶中抗氧化活性成分的目标部位。研究雪莲果叶中抗氧化活性成分，将其发展成为抗氧化活性试剂的植物源，发挥其药用价值具有重要的社会经济意义。

[1] 焦琳娟，何旭英. 微波辅助提取雪莲果中绿原酸及其纯化的工艺研究[J]. 食品科技，2015，40(11)：230-234.

[2] 盖阔，田芳，窦德强，等. HPLC测定亚贡叶中绿原酸及咖啡酸含量[J]. 中国现代中药，2008，10(1)：17-19.

[3] 魏清榕，窦德强，田芳，等. HPLC法测定亚贡叶中绿原酸的含量[J]. 中华中医药学刊，2008，26(3)：580-581.

[4] 刘坚，李静威，兰海，等. 雪莲果不同部位的营养成分分析[J]. 草业学报，2009，18(4)：236-240.

[5] 陈红惠，徐保立，彭光华. 薄层色谱法分离鉴定雪莲果叶中的绿原酸[J]. 食品研究与开发，2010，31(10)：134-138.

[6] 杨欣欣，包永睿，王帅，等. 不同采收期金银花药材质量评价研究[J]. 时珍国医国药，2015，26(6)：1466-1468.

[7] 陈绍华，王亚琴，罗立新.天然产物绿原酸的研究进展[J]. 食品科技，2008，33(2)：195-199.

[8] 王永丽，尉小慧，刘伟，等. 不同产地艾叶炮制前后总酚酸的含量比较研究[J]. 时珍国医国药，2015，26(1)：88-90.

[9] Turkoglu A, Duru M E, Mercan N, et al. Antioxidant and antimicrobial activities ofLaetiporussulphureus(Bull.) Murrill[J]. Food Chem, 2007, 101(1): 267-273.

[10] Re R, Pellegrini N, Proteggente A, et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radic Biol Med, 1999, 26(9/10): 1231-1237.

[11] Yu W L, Zhao Y P, Shu B. The radical scavenging activities of radix puerariae isoflavonoids: A chemiluminescence study[J]. Food Chem, 2004, 86(4): 525-529.

[12] Valentová K, Lebeda A, Dolezalová I, et al. The biological and chemical variability of yacon [J]. J Agric Food Chem, 2006, 54(4): 1347-1352.

[收稿2016-07-26;修回2016-09-27]

(编辑：王 静)

Study on the anti-oxidant activities of extract of Smallanthus sonchifolius leaves

YuanXiaoyan,ZhangFeng

(Department of Analytical Chemistry, School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective Extraction and separation ofSmallanthussonchifoliusleaves，and the anti-oxidant activity of crude extract and fractions of different polarity were tested， to make the leave ofS.sonchifoliusas a promising natural antioxidant source.Methods TheS.sonchifoliuswas extracted by 70% ethanol, then extracted with petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol to get five fractions, including petroleum ether fraction (PE fra.), ethyl acetate fraction (EA fra.), n-butanol fraction (NB fra.), Water fraction (WT fra.) and crude extact (CE) Then，the total phenolic content and the anti-oxidant activities，including DPPH, ABTS+, OH radicals scavenging activity of the crude extract and fractions were tested.Results The leaves ofS.sonchifoliuspossessed strong radical scavenging activities, especially the ethyl acetate fraction，possessing the highest total phenolic content reaching (29.93 ± 0.31)mg/g，and the strongest anti-oxidant activities toward DPPH, ABTS+, OH radicals with SC50of (37.96 ± 0.43, 29.46 ± 1.05, 1.67 ± 0.03)μg/ml, respectively. The anti-oxidant activity of extract ofS.sonchifoliusleaves were higher than frequently-used antioxidant butylated hydroxytoluene (BHT)(P<0.05).Conclusion The anti-oxidant active components ofS.sonchifoliusleaves concentrated in ethyl acetate fraction, polyphenol acids could be major ingredients for the anti-oxidant activities ofS.sonchifoliusleaves.

Smallanthussonchifolius; leaves; anti-oxidant activities; extraction; separation

贵州省联合基金资助项目(NO：CK-881)；遵义医学院博士启动基金资助项目(NO：F-635)。

R284

A

1000-2715(2016)05-0483-04