和厚朴酚对人神经胶质瘤U87细胞的体内外抗肿瘤作用

王 敏，林 茂，马晓莉，王宇婷，邵楚莹，杜飞嫦，潘伟明，魏 培

(1.广东医科大学 分子诊断重点实验室，广东 东莞 523808；2.遵义医学院 珠海校区药学教研室，广东 珠海 519041；3.遵义医学院 珠海校区生理学教研室，广东 珠海 519041；4.广东医科大学 医学检验学院，广东 东莞 523808)



基础医学研究

和厚朴酚对人神经胶质瘤U87细胞的体内外抗肿瘤作用

王 敏1,2，林 茂3，马晓莉4，王宇婷4，邵楚莹4，杜飞嫦4，潘伟明4，魏 培1

(1.广东医科大学 分子诊断重点实验室，广东 东莞 523808；2.遵义医学院 珠海校区药学教研室，广东 珠海 519041；3.遵义医学院 珠海校区生理学教研室，广东 珠海 519041；4.广东医科大学 医学检验学院，广东 东莞 523808)

目的 探讨和厚朴酚对U87人神经胶质瘤的体内外抑制作用。方法 CCK8法及克隆形成实验检测和厚朴酚对U87细胞的增殖抑制，DAPI染色及caspase 3活性试验检测和厚朴酚对肿瘤细胞凋亡的影响。建立裸小鼠移植瘤模型，连续腹腔注射给药，通过计算肿瘤体积评价和厚朴酚体内抑瘤效果，免疫组化检测EGFR和mTOR的表达。结果 细胞实验显示，与对照组相比，和厚朴酚处理组U87细胞增殖减慢，细胞克隆形成能力下降，细胞凋亡率升高，caspase 3活性增强 (P<0.01)。在体实验显示，与对照组相比，和厚朴酚治疗组移植瘤体积减小、 EGFR和mTOR的表达明显降低(P<0.01)。结论 和厚朴酚能抑制U87肿瘤细胞体内外的生长，其机制可能与抑制mTOR和EGFR的表达并诱导凋亡有关。

神经胶质瘤；和厚朴酚；细胞生长；凋亡；表皮生长因子受体

神经胶质瘤是一种发病率逐年升高的脑部实体肿瘤，严重威胁着人类健康[1-2]。限于其发病部位的特殊性，常规的手术治疗和化疗都受到严重制约，靶向治疗成为其新希望。原发性恶性胶质瘤的分子改变以EGFR的扩增与过量表达为主，因此EGFR可能成为胶质瘤的有效靶点之一[3-4]。一些天然的药用植物成分，因其无或很小的毒副作用，可作为传统或靶向治疗的辅助甚至替代手段。和厚朴酚(Honokiol)是从厚朴中提取的联苯二酚类化合物，与厚朴酚属同分异构体，其抗癌作用已在乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和神经胶质瘤等多种肿瘤中被证实[5-7]。在神经胶质瘤中，研究发现和厚朴酚对神经胶质瘤的作用主要是通过诱导凋亡及阻滞细胞周期进行，其机制涉及MAPK和STAT3通路的抑制及增加缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-lα, HIF-1α)的泛素化等[8-9]。以上分子均与EGFR的信号通路密切相关，但胶质瘤中EGFR是否作为和厚朴酚的作用靶点存在还未见报道。因此本研究通过建立人U87神经胶质瘤小鼠移植瘤模型，探讨和厚朴酚对U87人神经胶质瘤体内外抑制作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 人神经胶质瘤U87细胞株购自南京恩晶生物公司；DMEM培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司；CCK-8细胞增殖试剂盒和Caspase 3分光光度法检测试剂盒购自海门碧云天生物公司；和厚朴酚(溶于乙醇，PBS稀释)购自大连美仑生物公司；EGFR抗体和mTOR抗体购自四正柏生物公司；鼠/兔免疫组化试剂盒购自长沙艾佳生物公司；4～6周龄BALB/c裸小鼠，体质量19～22 g，许可证号SCXK(粤)2013-0008，购自南方医科大学实验动物中心；其它试剂均为分析纯。

1.2 细胞培养 人神经胶质瘤U87细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM中，在37 °C、5% CO2的饱和湿度培养箱中常规培养。细胞生长至密度约80%时，0.25%的胰蛋白酶消化传代并经台盼蓝染色计数，所有实验均采用对数生长期细胞。

1.3 细胞增殖检测 对数生长期细胞以2×103/孔密度接种96孔板，37 °C、5% CO2的饱和湿度培养箱中过夜培养。随后不同浓度的和厚朴酚(0、15、30、50 μmol/L，每组5个复孔)分别作用24和48 h。到达作用时间后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养1.5 h后于酶标仪读取A450值。按照公式[细胞增殖抑制率(%) =(A对照组-A处理组)/A对照组×100%]计算抑制率，绘制生长曲线。

1.4 克隆形成实验 对数生长期细胞以1 000个/皿接种于35 mm细胞培养皿，37° C、5% CO2的饱和湿度培养箱中过夜培养。随后加入不同浓度的和厚朴酚(0、15、30、50 μmol/L，每组重复3次)作用，3 d后更换新鲜培养基继续培养。当出现肉眼可见的细胞克隆时，终止培养。弃去培养基，用PBS洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞20 min。去固定液，0.1%结晶紫染色10 min，然后洗去染色液，空气干燥后计算克隆形成率。

1.5 DAPI染色及caspase 3活性检测 细胞经和厚朴酚处理24 h后弃上清，经PBS洗2次后用4%多聚甲醛固定15 min，DAPI工作液室温染色15 min，PBS洗涤2次后荧光显微镜下观察细胞核形态。Caspase3活性检测按试剂盒方法操作方法进行：收集细胞，PBS洗3次。加入裂解液冰浴15 min。4 °C、16 000 g离心15 min后转移上清到另一离心管中，同时取少量样品用考马斯亮蓝法定量。样品孔每孔加入10 μL样品、80 μL检测缓冲液和10 μL Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)，充分混匀。37° C避光孵育120 min后酶标仪测定405 nm处吸光度值。通过样品组、空白组和标准品组的pNA量对比计算出样品组caspase-3活性。

1.6 小鼠移植瘤模型建立 细胞经0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞悬液，离心后用无血清培养基重悬，调整浓度为2×107/mL，以1 mL无菌注射器抽取细胞悬液，于每只小鼠右侧胁部皮下注射0.1 mL。10 d后小鼠皮下可触及明显肿块，隆起于皮肤表面，呈不规则状，边界清楚，直径3～4 mm，提示小鼠皮下移植瘤模型建立成功。

1.7 动物分组及处理 将已构建移植瘤的小鼠随机分为2组，每组8只，即PBS对照组(腹腔注射等体积PBS，0.1 mL/只)；和厚朴酚组(腹腔注射和厚朴酚稀释液20 mg/kg)；均为每天给药1次，连续21 d。脱颈椎处死并解剖小鼠，完整剥取移植瘤, 用游标卡尺测长、短径，并计算瘤体积抑制率。肿瘤经10%甲醛固定后石蜡包埋切片，按照常规免疫组化操作步骤操作，观察移植瘤组织mTOR和EGFR表达情况，并计算平均光密度=积分光密度值/有效区域面积。

2 结果

2.1 和厚朴酚对U87细胞生长的影响 和厚朴酚对U87细胞生长的抑制作用通过细胞活力及细胞克隆形成能力评估。如图1A所示，和厚朴酚处理组细胞增殖逐渐减慢，50 μmol/L和厚朴酚作用24及48 h后细胞相对增殖活力分别为47%±6.37%和22%±3.58%；与对照组相比，细胞生长受到明显抑制(P<0.01)。克隆形成实验结果显示(见图1B)，与对照组相比，和厚朴酚对U87细胞的克隆形成抑制，且随浓度升高而增大，50 μmol/L和厚朴酚处理组克隆抑制率可达92%±3.46%，差异有统计学意义(P<0.01)，以上结果表明，和厚朴酚可明显抑制U87细胞体外增殖。

与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。图1 和厚朴酚对U87细胞活力(A)及克隆形成(B)的抑制作用

2.2 和厚朴酚对U87细胞凋亡的影响 和厚朴酚对U87细胞凋亡的影响通过DAPI染色及caspase 3活性检测。结果如图2A所示，与对照组相比，50 μmol/L和厚朴酚处理组细胞形态呈现核固缩和碎裂等凋亡样改变(箭头所示)，表明和厚朴酚可诱导细胞凋亡发生。Caspase 3活性检测结果表明(见图2B)，50 μmol/L和厚朴酚作用后U87细胞caspase 3活性增强，差异有统计学意义(P<0.01)，提示其凋亡的发生可能与caspase 3激活有关。

与对照组相比，**P<0.01。图2 和厚朴酚对U87细胞核形态(A)及caspase 3活性(B)的影响

2.3 和厚朴酚对小鼠移植瘤的抑制作用 和厚朴酚治疗后，小鼠饮食、行为和精神状态与对照组相比均无明显异常，且治疗组小鼠体重与对照组相比无显著性差异(见图3B)。治疗组移植瘤生长相对缓慢，肿瘤体积具有显著差异(P<0.01，见图3A)。免疫组化染色结果表明，与对照组相比，治疗组移植瘤组织中EGFR和mTOR的表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05，见图3C和3D)。

与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。图3 和厚朴酚对U87小鼠移植瘤生长(A)、小鼠体重(B)、EGFR和mTOR表达水平(C)、 (D)的影响

3 讨论

胶质瘤的发生和发展过程中涉及多个基因的异常表达，研究表明，EGFR的扩增与胶质瘤的预后不良和复发明显相关，被认为是胶质瘤恶性演进和耐药性的关键因素之一。EGFR是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的膜受体，与配体(如EGF)结合后活化，激活下游磷酸肌醇3激酶(PI3K)等多条信号通路，参与肿瘤细胞的生长和侵袭[10-12]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是PI3K通路的下游效应器，与EGFR有着密切的交叉联系，在胶质瘤的恶性演化中同样起着重要作用[9]。联合靶向EGFR和mTOR对恶性胶质瘤的治疗具有重要意义。

目前，靶向EGFR和mTOR等蛋白激酶的药物主要为这些激酶的抑制剂，虽然与传统化疗药物相比具有较低的毒副作用，但仍然会对患者的生理和心理健康造成严重影响。因此，一些无毒副作用的天然药用植物成分已成为靶向治疗的研究热点。和厚朴酚属联苯酚类化合物，为木兰科木兰属植物厚朴的主要成分之一。近年来研究表明，和厚朴酚除具有止痛健胃、活血化瘀的功效外，可对多种肿瘤发挥较好的抑制作用[5-6]。和厚朴酚对神经胶质瘤的作用也有报道，如董怡[8]发现，和厚朴酚通过增强HIF1-α的泛素化降解进而抑制U87细胞的生长；而张玉宝[9]研究表明和厚朴酚通过抑制ERK1/2和STAT3信号通路促进U87细胞的凋亡及细胞周期组织。鉴于EGFR和mTOR与以上信号通路及肿瘤细胞的生长和细胞周期密切相关，本实验以人神经胶质瘤U87细胞为模型，探讨了和厚朴酚对其体内外的抑制效果。通过细胞增殖和克隆形成试验检测发现，不同浓度和厚朴酚处理可明显抑制U87细胞活力，降低其克隆形成率，提示和厚朴酚可抑制U87细胞的体外生长。细胞生长抑制可由多种原因引起，诱导凋亡发生是关键的因素之一[13]。为明确和厚朴酚抑制U87细胞生长的机制，本研究通过细胞核形态观察及caspase 3活性检测了和厚朴酚对细胞凋亡的影响。结果表明和厚朴酚可诱导肿瘤细胞发生明显的凋亡现象。已有研究证实，EGFR为和厚朴酚的主要治疗靶点且与介导治疗后凋亡的发生[14]。因此，我们通过体内实验进一步观察了和厚朴酚对小鼠移植瘤的抑制作用，并检测了对EGFR及其下游mTOR蛋白表达的影响。体内实验同样显示和厚朴酚对肿瘤生长的抑制作用，同时发现和厚朴酚可明显降低肿瘤组织EGFR及mTOR蛋白的表达，表明和厚朴酚可能通过靶向EGFR及mTOR进而抑制肿瘤生长。

肿瘤的治疗不仅需要考虑其疗效，更低的毒副作用也是必要的衡量标准。本实验结果发现，和厚朴酚在不引起小鼠体重变化的同时，可作为靶向EGFR及mTOR的有效治疗手段。而和厚朴酚对胶质瘤细胞作用的其他具体机制，还需更多的体内外实验进一步识别与验证。

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[收稿2016-06-29;修回2016-08-13]

(编辑：王 静)

Study of the inhibitory effects of honokiol in human U87 glioma cells

WangMin1,2,LinMao3,MaXiaoli4,WangYuting4,ShaoChuying4,DuFeichang4,PanWeiming4,WeiPei1

(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics, Guangdong Medical University, Dongguan Guangdong 523808, China;2.Department of Pharmacy, Zhuhai Campus of Zunyi Medical University, Zhuhai Guangdong 519041, China; 3.Department of Physiology, Zhuhai Campus of Zunyi Medical University, Zhuhai Guangdong 519041, China; 4.School of Medical Laboratory Science, Guangdong Medical University, Dongguan Guangdong 523808, China)

Objective To detect the inhibitory effects of honokiol on U87 human glioma cells in vitro and in vivo.Methods Using CCK-8 assay and colony formation assay to measure the growth inhibition rate; cell apoptosis was tested by DAPI staining and caspase 3 activity assay. The U87 cancer cells were subcutaneously inoculated into nude mice respectively and the tumor volumes were observed after treatment; moreover, the expressions of EGFR and mTOR were detected by immunohistochemical staining. Results Cell experiment demonstrated that compared with the control group U87 cell growth rate of honokiol group was decreased and cloning ability was declined. Further more, cell apoptosis rate of honokiol group was increased and caspase 3 activity was enhanced (P<0.01). In vivo experimental results showed that compared with the control group the volume of tumor in honokiol group was reduced and the expressions of EGFR and mTOR were declined significantly (P<0.01).Conclusion Honokiol could inhibit the growth of U87 human glioma cells in vitro and in vivo, which was associated with activation of apoptosis and reduced expressions of EGFR and mTOR.

glioma; honokiol; cell growth; apoptosis; EGFR

国家自然科学青年基金资助项目(NO：81503104)；广东省医学科研基金资助项目(NO：B2014300)；广东医科大学大学生创新项目(NO：2014ZYDC002; LYDC003)。

R739.4

A

1000-2715(2016)05-459-05