Nycodenz密度梯度离心法提取及纯化大鼠心肌线粒体

李 科，魏义勇，刘 云，曹 嵩，刘兴奎，王海英，喻 田

(1. 遵义医学院附属口腔医院 麻醉科，贵州 遵义 563099； 2. 遵义医学院附属医院 麻醉科，贵州 遵义 563099；3. 遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099)



技术与方法

Nycodenz密度梯度离心法提取及纯化大鼠心肌线粒体

李 科1，魏义勇2，刘 云3，曹 嵩2，刘兴奎2，王海英2，喻 田2

(1. 遵义医学院附属口腔医院 麻醉科，贵州 遵义 563099； 2. 遵义医学院附属医院 麻醉科，贵州 遵义 563099；3. 遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099)

目的 建立一种利用Nycodenz密度梯度离心法提取组织线粒体的方法。方法 传统离心方法得到粗提线粒体后，在Nycodenz密度梯度介质中超高速离心得到纯化线粒体，进一步在经改良的线粒体分离介质中重复离心2次，得到高纯度的线粒体。利用透射电镜和Western Blot检测线粒体纯度。结果 使用Nycodenz密度梯度离心法和线粒体分离介质提纯的线粒体量多、纯度较高(COX Ⅳ含量纯化组：粗提组=220%±26%vs.160%±34%，P<0.05)，且电镜照片显示结构完整。结论 使用Nycodenz密度梯度离心法可获得高纯度且结构较完整的线粒体。

线粒体；密度梯度离心法；Nycodenz;大鼠

线粒体作为机体主要能量来源的细胞器，历来是细胞和分子生物学研究的焦点。近年来，随着生物学技术的发展，对线粒体的研究领域也不断拓宽，其中包括线粒体蛋白组学[1-2]、线粒体表观遗传学[3]、自噬[4]，线粒体的进化生物学[5]，线粒体分子病[6]等。线粒体在许多疾病中扮演着重要角色，因此，从动物或人体组织中提取线粒体作为研究的基础模型很有现实意义。从动物组织或细胞系中提取线粒体的方法报道较少[7-9]，国内更是鲜有报道[10]，因此各实验室提取条件不尽相同，尤其是提取液成分各异，或细节注意不够，这就使得提取的线粒体的数量和质量得不到保证，最终还会影响依赖线粒体进行的下一步研究结果。现以从成年大鼠心肌细胞提取线粒体的提取方法为例，讨论如何从动物组织中提取并纯化线粒体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠，重250～300 g，4～5月龄(由第三军医大学提供)。

1.1.2 主要试剂 K-H液，成分(单位mmol/L)：NaCl 118.00、NaHCO324.80、KCl 4.75、CaCl22.50、MgCl2·6H2O 1.19、KH2PO41.19、葡萄糖11.1、线粒体分离介质(210 mmol/L mannitol、5 mmol/L Tris-HCl、70 mmol/L sucrose、1 mmol/L EDTA，pH =7.4)、Nycodenz密度梯度介质(20%～34%，溶于线粒体分离介质)、裂解液(7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、5 mmol/L EGTA、4% CHAPS、65 mmol/L DTT，pH =7.4)等[11]。以上试剂购自Sigma公司或Amresco公司。BCA蛋白定量试剂盒购自江苏碧云天公司。

1.1.3 主要仪器 垂直凝胶电泳仪(Bio-Rad，美国)、高速离心机(Thermo Fisher，美国)、超速离心机(Beckman，美国)、透射电镜(HITACHI，日本)、Odyssey红外荧光成像系统(Licor，美国)。

1.2 方法

1.2.1 心肌取材 腹腔给予40 mg/kg异戊巴比妥钠麻醉大鼠，迅速打开胸腔，剪下心脏，放入4 °C预冷且置于冰上的K-H液中[11- 12]，剪下心室肌，洗净。

1.2.2 线粒体提取及纯化 以下步骤均在冰浴条件下操作。按图1所示流程，心室肌置于线粒体分离介质，剪去结缔组织，在50 mL离心管中剪碎成1 mm3左右的组织块，使用电动匀浆器(IKEA，Sweden)进行组织匀浆，匀浆10 s，间隔10 s，直至无肉眼可见的组织块；4 °C，1 000g，离心匀浆10 min，转移上清液至另一离心管中，4 °C，1 000g，离心 10 min，沉淀即为粗提线粒体。将1.2 mL 25% Nycodenz 密度梯度介质加入粗提线粒体中，在冰浴中充分吹打均匀， 5 mL离心管，按图2A 所示的顺序及体积，将密度梯度介质铺层，4 °C，100 000g，离心 60 min；密度梯度离心结束后，将线粒体层的混合物转移至1.5 mL Ep管，用1倍体积的线粒体分离介质液涡旋混匀，4 °C，15 000g，离心 10 min，沉淀即为纯化的线粒体[11]。

图1 Nycodenz密度梯度离心法分离提纯线粒体流程图

1.2.3 Western Blot检测线粒体纯度 线粒体裂解液冰浴纯化线粒体，超声破碎3 min，4 °C、20 000g，离心30 min，上清即线粒体蛋白。BCA蛋白定量试剂盒行线粒体总蛋白定量。Western Blot法测定每组各亚细胞器标志性蛋白(COX Ⅳ，线粒体内膜标志物)、(β-actin，细胞膜标志物)、(Calnexin，内质网标志物)和(GADPH，细胞浆蛋白标志物)的含量。参照文献[13- 14]，行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，一抗、荧光二抗孵育，Odyssey荧光成像系统曝光，统计荧光值。

1.2.4 透射电镜观察线粒体结构 3%戊二醛和1%锇酸固定线粒体后70%酒精和醋酸双氧过饱和溶液浸泡过夜，在接受90%酒精和90%丙酮浸泡、100%丙酮洗涤、100%丙酮、包膜脂按照1∶1的比例混合后35 °C包埋过夜。行超薄切片，柠檬酸铅染色后透射电镜下观察。

2 结果

2.1 线粒体的提取 Nycodenz密度梯度介质在离心管中的铺层(见图2A)，初次离心后可得到粗提线粒体(见图2B)；进一步Nycodenz密度梯度离心后粗提线粒体成分分为两部分：溶于23%～25%密度层的较纯线粒体(见图2C)和溶于25%～30%层的细胞碎片和线粒体杂质(见图2D)。

A：Nycodenz密度梯度介质在离心管中的铺层示意图；B：粗提线粒体；C～D：Nycodenz密度梯度介质中离心后的线粒体和细胞碎片及线粒体杂质的分层及电镜图像。 图2 Nycodenz密度梯度离心法分离及提纯线粒体

2.2 线粒体纯度的验证 使用Western Blot法检测心肌细胞各亚细胞器标志蛋白的表达(见图3A)。以组织匀浆组作为参照(100%)，纯化组COX Ⅳ的含量明显高于粗提组(220%±26% vs.160%±34%，P<0.05)。纯化组β-actin、Calnexin和GADPH的含量明显低于粗提组(P<0.05，见图3B)。

A：Western Blot检测线粒体纯度；B：荧光定量，n=3，*：P<0.05。 图3 各亚细胞器标志蛋白表达的免疫印迹图及荧光值定量

3 讨论

线粒体对渗透压非常敏感，因此分离介质的渗透压必需接近在体水平以保持线粒体结构的完整性。据报道，最佳的线粒体分离介质是蔗糖与甘露醇的混合溶液。离体线粒体保存液中的Mg2+、Ca2+等离子渗透入线粒体会造成线粒体的肿胀甚至裂解。在线粒体分离介质中加入EDTA可以鳌合溶液中的金属离子，有助于保持线粒体的完整。此外，pH是另一影响线粒体稳定的关键因素。本实验使用到的线粒体分离介质经过了优化改进，其渗透压在体范围(290～310 mOsm/L)，可以最大程度地保持线粒体结构与功能的完整。

采用机械方法裂解细胞获得的线粒体结构较完整。相比化学裂解，机械破碎线粒体排除了反复冻融、裂解用的有机溶剂等对线粒体造成的损伤，因此本研究中采用内切式高速匀浆机进行心肌组织裂解。

差速离心法分离线粒体是基于线粒体的重量、密度与形状与其他细胞组分的不同。差速离心去除了细胞核、未破裂细胞与其他亚细胞成分，但差速离心沉淀线粒体的同时伴有细胞膜、内质网、过氧化物酶体等密度与线粒体相近的其他细胞组分的混入。本研究在差速离心的基础上加入不连续Nycodenz密度梯度离心。不同密度的亚细胞器能在不同浓度的密度梯度介质里稳定在某一位置从而将不同密度的细胞成分区分开来。Nycodenz密度梯度介质为目前分离纯化线粒体的良好介质，我们在文献[15]基础上稍作改进，在Nycodenz的溶剂选择上，使用了线粒体分离介质取代0.25 mol/L蔗糖，因为和蔗糖溶液相比，线粒体分离介质的成分更接近在体条件，进一步保持了线粒体的完整性。

我们从细胞各组分生物标识物的角度出发，利用各亚细胞器特异的标识蛋白，辅以Western Blot来验证线粒体的纯度。以细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ(COX Ⅳ)作为线粒体内膜标志物，以及内质网、骨架/质膜及胞浆特异标志物证实了纯化线粒体所含其它亚细胞器成分较少，说明线粒体纯度较高。

本实验介绍的Nycodenz 不连续密度梯度离心法可以提取并纯化大鼠心肌线粒体，纯化的线粒体将为以线粒体为模型的研究提供基本保障。

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[收稿2016-08-08;修回2016-09-10]

(编辑：王 静)

Isolation and purification of rat myocardial mitochondria with Nycodenz density gradient centrifugation

LiKe1,WeiYiyong2,LiuYun3,CaoSong2,LiuXingkui2,WangHaiying2,YuTian2

(1.Department of Anesthesiology,Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China；2.Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China；3.Research Center for Medicine & Biology,Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To introduce a tissue mitochondria isolation and purification method with Nycodenz density gradient centrifugation. Methods Mitochondria obtained by traditional centrifugation method were subjected to super-centrifugation in different density Nycodenz layers before centrifugation twice in modified mitochondrial isolation media. Electron microscopy and Western Blot were employed to test the purity of mitochondria. Results Mitochondria obtained with Nycodenz density gradient centrifugation and our modified mitochondrial isolation media were more abundant and purer than that from the traditional method. Conclusion Nycodenz density gradient centrifugation is an optimal method to get pure and structural integrity mitochondria.

mitochondria; density gradient centrifugation; Nycodenz;rat

卫生部公益性行业科研专项(NO：200802173)；贵州省科技厅、遵义市科技局、遵义医学院联合基金资助项目(NO:黔科合J字LKZ[2013]31)。

喻田，女，硕士，教授，博士生导师，研究方向：全身麻醉机制、疼痛相关机制、心肌保护，E-mail:zunyiyutian@163.com。

R363

A

1000-2715(2016)05-0525-04