黔产小叶黄杨中环维黄杨星D的鉴别及不同部位含量测定

杨娟艳, 王 芳, 郭 婷, 吴琳琳, 黄红梅, 许乾丽, 茅向军*

1.贵阳中医学院, 贵阳 550002;2.贵州省食品药品检验所, 贵阳 550004;3.遵义医学院, 贵州 遵义 563003;4.贵州医科大学, 贵阳 550004



黔产小叶黄杨中环维黄杨星D的鉴别及不同部位含量测定

杨娟艳1,2, 王 芳3, 郭 婷4, 吴琳琳4, 黄红梅1, 许乾丽2, 茅向军2*

1.贵阳中医学院, 贵阳 550002;2.贵州省食品药品检验所, 贵阳 550004;3.遵义医学院, 贵州 遵义 563003;4.贵州医科大学, 贵阳 550004

对黔产小叶黄杨中环维黄杨星D进行薄层色谱研究，并比较了小叶黄杨不同部位环维黄杨星D的含量，为合理开发小叶黄杨的药用资源提供科学依据。采用薄层色谱法对小叶黄杨中环维黄杨星D进行薄层色谱研究，采用高效液相色谱电喷雾检测器法对小叶黄杨不同部位环维黄杨星D进行含量测定。结果显示：薄层色谱中环维黄杨星D斑点清晰；高效液相色谱中小叶黄杨不同部位环维黄杨星D的含量差异很大，粗茎含量最高，叶子含量最低。该方法可用于小叶黄杨的薄层鉴别和含量测定，为了合理开发和利用黔产小叶黄杨，其药用部位以粗茎最好。

小叶黄杨；薄层色谱；不同部位；环维黄杨星D

小叶黄杨 (Buxussinica) 属黄杨科(Buxaceae)黄杨属(Buxus)植物，主要用于风湿痹痛、胸腹气胀、牙痛、胸痹心痛等治疗。小叶黄杨中主要含有生物碱类、黄酮类、苷类、羽扇豆烷醇、β-谷甾醇、木脂素、有机酸类等成分[1～5]，其中环维黄杨星D是小叶黄杨及同属植物提取精制所得的甾体生物碱[6]，对心衰及心肌细胞受损都具有保护作用[7,8]，可用于心绞痛、心律失常、冠心病等治疗[9]。目前，以环维黄杨星D和小叶黄杨为主要原料的制剂分别有黄杨宁片、宁心滴丸和心脑宁胶囊，该类制剂对心脑血管疾病具有很好的治疗效果[10～12]。《中国药典》(2015年版)中对环维黄杨星D提取物采用非水滴定法测定[13]，该方法测总生物碱灵敏度较低。由于环维黄杨星D紫外吸收弱，普通的检测器很难检测，相关文献报道[14,15]对样品先衍生化，再用HPLC/UV或者HPLC/MS测定，但操作较为繁琐。

为了合理开发利用小叶黄杨资源，以及为相关药品生产企业有效药用的使用提供参考，本文对小叶黄杨中环维黄杨星D建立了薄层鉴别方法，同时建立了高效液相色谱电喷雾检测器 (HPLC-CAD) 法测定黔产小叶黄杨不同部位环维黄杨星D的含量。该法操作简单、结果准确，可用于小叶黄杨的定性研究，为弱紫外吸收的环维黄杨星D提供了新的检测方法，同时为小叶黄杨药用部位的选择和质量控制提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国戴安公司)；Corona电子喷雾检测器(美国戴安公司)；FE20 pH计和XS205电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；DZKW-4电子恒温水浴锅(南昌市恒顺化验设备制备有限公司)；高效硅胶G(青岛海洋化工厂)；0.45 μm的微孔滤膜。

1.2 试剂与标准品

环维黄杨星D (100%，批号：110888-200503，中国食品药品检定研究院)；乙腈为色谱纯；试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3 小叶黄杨药材

小叶黄杨药材于2012-2015年在贵州扎佐、贵定、六屯等地采集，经贵州省食品药品检验所中药标本馆李杨馆长鉴定为黄杨科黄杨属植物小叶黄杨[Buxussinica(Rehd. etWils)Cheng]。采集的药材阴干打粉后，置干燥器中储存。

1.4 试验方法

1.4.1 薄层色谱 取小叶黄杨粗粉约4.0 g，置100 mL锥形瓶中，加浓氨水5 mL，拌匀，静置10 min。加入氯仿25 mL，超声1 h，放冷，滤过，滤液挥发至约2 mL。称取干燥至恒重的环维黄杨星D对照品适量，用氯仿制成浓度为0.02 mg/mL的对照品溶液。

分别吸取薄层色谱对照品溶液和薄层色谱供试品溶液各5 μL，点于同一高效硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-氨水(10∶1∶0.05∶0.5)作为展开剂，饱和20 min，上行展开1～2 cm后，晾干，再用石油醚(60～90℃)-氯仿-丙酮-甲醇-二乙胺(5.5∶4∶1.4∶0.2∶0.2)二次展开至约7.5 cm，取出，晾干，先后喷以稀碘化铋钾溶液和亚硝酸钠乙醇溶液，挥干薄层板上的残留溶剂后，置日光灯下检视。

1.4.2 高效液相色谱 取小叶黄杨粗粉(细枝)约2.0 g，精密称定，置150 mL锥形瓶中，加氨水5 mL，摇匀，浸润30 min。加入氯仿40 mL，水浴回流3 h，放冷，过滤，用5 mL三氯甲烷将锥形瓶和滤纸上的残渣少量多次一并洗入滤纸内过滤，滤液水浴蒸干。残渣用10 mL 0.5%醋酸超声使其溶解，稀氨水调节pH至7.0，分别用氯仿10 mL、醋酸乙酯10 mL萃取，分离并收集水相，水浴蒸干[16]，残渣用0.05%TFA 溶液溶解后转移至10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过。

精密称取环维黄杨星D对照品0.012 74 g，置50 mL量瓶中，加适量甲醇溶解后，用0.05% TFA 稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备溶液(0.254 6 mg/mL)。分别精密量取对照品储备溶液0.1 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL置5 mL量瓶中，用0.05% TFA稀释至刻度，摇匀，作为线性对照品溶液。再取对照品储备溶液适量，加0.05%三氟乙酸(0.05% TFA) 溶液制成0.020 mg/mL的对照品溶液，按以下条件测定。

测定条件：色谱柱为 Waters Xbridge® C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)和0.05%TFA(B)；梯度洗脱，0～3 min，12% ～15% A；3～8 min，15%～19% A；8～12 min，19%～24% A；15～18 min，12% A；电喷雾雾化温度30℃，气压35.0 psi；流速1.0 mL/min；进样量20 μL；柱温35℃。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱鉴别

薄层色谱结果见图1(彩图见封三图版)，供试品色谱图中，在与对照品色谱(条带3)相应的位置上，显现相同颜色的橘黄色斑点，分离度良好且斑点清晰，说明薄层色谱适于鉴别环维黄杨星D。

图1 小叶黄杨薄层色谱图Fig.1 The TLC results of Buxus sinica.注：1，2，4，5为小叶黄杨供试品；3为环维黄杨星D对照品。 (彩图见封三图版)

2.2 不同部位含量测定

2.2.1 高效液相色谱测定不同部位的环维黄杨星D含量 用高效液相色谱法测定小叶黄杨不同部位的环维黄杨星D含量结果见图2，环维黄杨星D峰形对称，与相邻的色谱峰分离度良好。

2.2.2 线性关系考察 按照1.5.2的方法记录色谱图，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线(图3)，得环维黄杨星D的回归方程和相关系数为：Y=44.39X+0.1009，r=0.999 5，结果表明，环维黄杨星D在0.005 092～0.203 7 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.3 精密度试验 精密量取环维黄杨星D对照品溶液(0.020 mg/mL)适量，按1.5.2的条件连续进样6次，计算环维黄杨星D峰面积的RSD为0.87%，结果表明，仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验 分别于供试品溶液制备后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h按1.5.2的条件测定，计算环维黄杨星D平均含量为0.078 mg/g，RSD为1.40%，结果说明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

图2 环维黄杨星D对照及小叶黄杨各部位供试品的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of cyclovirobuxine D in different parts of Buxus sinica. A.对照品；B.小叶黄杨叶；C.小叶黄杨细枝；D.小叶黄杨粗茎

图3 环维黄杨星D标准曲线图Fig.3 The standard curve of cyclovirobuxine D.

2.2.5 重复性试验 精密称取同一样品6份，按1.4.2项下的方法制备成供试品溶液并测定，计算环维黄杨星D平均含量为0.070 mg/g，RSD为0.99%，结果表明该方法重复性良好。

2.2.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的小叶黄杨粗粉共6份，每份1.0 g，分别加入环维黄杨星D对照品溶液(精密吸取对照品储备液3.0 mL置于25 mL量瓶中，用0.05% TFA稀释至刻度)2.3 mL，混匀，按1.4.2项下的方法制备成供试品溶液并测定，计算环维黄杨星D平均回收率为102.9%，RSD 为3.6%，结果表明，该方法准确性良好(表1)。

2.2.7 样品含量测定 将采集到的11批小叶黄杨药材分为粗茎、细枝和叶3个部位，按1.4.2项下的方法分别制备供试品溶液，每份平行3次，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，测定结果见表2。由表2中数据可知，粗茎中环维黄杨星D含量明显高于细枝和叶，因此，环维黄杨星D的提取以粗茎为最好。

表1 小叶黄杨中环维黄杨星D的加样回收率试验 (n=6)

Table 1 Result of sample recovery rate of cyclovirobuxine D inBuxussinica(n=6).

编号称样量(g)原含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)11.00370.07020.07030.1448106.121.00280.07020.07030.1442105.331.00590.07040.07030.1458107.341.00430.07030.07030.140099.151.00560.07040.07030.140399.461.00120.07010.07030.1405100.1102.93.6

表2 小叶黄杨不同部位环维黄杨星D含量测定结果 (n=3)

Table 2 The cyclovirobuxine D content in different parts ofBuxussinica(n=3).

编号产地及生长年限采集时间粗茎含量(mg/g)RSD(%)细枝含量(mg/g)RSD(%)叶含量(mg/g)RSD(%)1云南大理2012年4月0.1010.610.0631.20.0471.72贵州六屯2014年10月0.1300.260.0860.890.0381.73贵州扎佐2014年12月0.1411.90.0590.230.0231.14贵州六屯2015年8月0.1000.510.0641.10.0382.15云南2015年8月0.3100.890.1341.80.0700.496贵州六屯1年生2015年9月0.2390.500.0721.20.0063.57贵州六屯3年生2015年9月0.1920.830.0541.10.0211.38贵州六屯5年生2015年9月0.4291.50.1291.30.0450.439贵州贵定种植2015年12月0.1610.400.0701.10.0121.110贵州贵定野生2015年12月0.0780.440.0121.50.0143.111贵州六屯2015年12月0.0940.470.0881.30.0520.50

3 讨论

薄层色谱条件中，曾采用药典中环维黄杨星D检查项下的展开剂[三氯甲烷-丙酮-二乙胺(5∶4∶0.4)]以及相关文献[17]的方法进行研究，色谱效果都不理想，当用极性较大的展开剂[乙酸乙酯-甲醇-氨水-水(10∶1∶0.5∶0.05)]进行一次展开后，再用极性较小的展开剂[石油醚(60～90℃)-氯仿-丙酮-甲醇-二乙胺(5.5∶4∶1.4∶0.2∶0.2)]进行二次展开时，样品中环维黄杨星D与邻近的斑点能较好的分离，且 Rf 值适宜。

本试验对黔产小叶黄杨粗茎、细枝和叶中环维黄杨星D含量进行测定，不同部位含量差异较大：粗茎>细枝>叶。小叶黄杨中环维黄杨星D含量最高的是粗茎，且粗茎比细枝中环维黄杨星D的含量高1～6倍左右，叶的含量最低。本研究得出的结论与报道的一致[18]，而《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)中记载小叶黄杨药用部位为枝叶，与本文结果有偏差。在试验过程中，采集了云南的2批药材与贵州产小叶黄杨作了对比，结果表明，黔产小叶黄杨与云南产小叶黄杨中环维黄杨星D的含量无太大差异。

由表2可知，不同生长年限(1年生、3年生和5年生)的小叶黄杨中环维黄杨星D的含量有差异，生长年限越长，环维黄杨星D的含量越高，但1年生和3年生含量差异较小，可能是生长年限在较小的范围内，小叶黄杨中环维黄杨星D的含量变化不大。

由于环维黄杨星D在200 nm处有最大吸收，谢昀等[16]采用反相离子对色谱法测定了黄杨木中环维黄杨星D的含量，本文在试验过程中也采用紫外检测器进行测定，结果发现，用紫外检测器测定、响应小、基线漂移，在测定叶的含量时，由于含量较低，无法准确测定，而用高效液相色谱电喷雾检测器测定时，响应大、基线平稳、定量准确。所以本实验最终采用HPLC-CAD法测定小叶黄杨中环维黄杨星D的含量。

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The TLC Identification and the Cyclovirobuxine D Content Determination in Different Parts ofBuxussinicafrom Guizhou

YANG Juan-yan1,2, WANG Fang3, GUO Ting4, WU Lin-lin4, HUANG Hong-mei1, XU Qian-li2, MAO Xiang-jun2*

1.GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China;2.GuizhouProvincialofFoodandDrugInspectionInstitute,Guiyang550004,China;3.GuizhouZunyiMedicalCollege,GuiZhouZunyi563003,China;4.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China

The paper studied the cyclovirobuxine D content of GuizhouBuxussinicawith thin-layer chromatography(TLC) profile, and compared the cyclovirobuxine D content in different parts of GuizhouBuxussinica, which was expected to provide scientific basis for the development ofBuxussinicaresources. The TLC was used to study cyclovirobuxine D profile inBuxussinica; a HPLC-CAD method was used to measure cyclovirobuxine D content in different parts ofBuxussinica. Results showed that cyclovirobuxine D spots were clear in the TLC; the main stem had the largest cyclovirobuxine D content but the lowest content in leaves. These methods could be used in thin-layer identification and content determination of theBuxussinica. In order to reasonable develop and utilize GuizhouBuxussinica, the best medicinal part is coarse stem.

Buxussinica; TLC; different parts; cyclovirobuxine D

2016-05-27; 接受日期：2016-07-06

贵州省科学技术基金(黔科合J字[2013]2032号)资助。

杨娟艳，硕士研究生，研究方向为中药及民族药质量控制与新药研究。E-mail:1274191418@qq.com。*通信作者：茅向军，主任药师，研究方向为药品质量研究。Tel:0851-86808857；E-mail:1074459931@qq.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.05.06