应用血红蛋白释放试验研究维生素C对红细胞氧化损伤的保护作用

李嘉欣，解彩霞，钱 多，苏 燕*

(1.包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头 014060；2.包头市第四医院检验科，内蒙古包头 014030)



应用血红蛋白释放试验研究维生素C对红细胞氧化损伤的保护作用

李嘉欣1，解彩霞1，钱 多2，苏 燕1*

(1.包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头 014060；2.包头市第四医院检验科，内蒙古包头 014030)

为了研究维生素C对氧化损伤红细胞的保护作用，用终浓度为0、2.5、5、10、20、40mL/L的过氧化氢(H2O2)溶液处理等体积维生素C作用后红细胞悬液(维生素C保护组)和维生素C未作用红细胞悬液(对照组)，测定红细胞相对溶解度和高铁血红蛋白(MetHb)含量，并用血红蛋白释放试验比较血红蛋白(Hb)释放差异。结果表明，维生素C保护组Hb释放量和相对溶解度均明显低于对照组(P<0.001)，MetHb含量虽然低于对照组(P<0.05)，但与H2O2浓度无相关性。说明维生素C对红细胞膜氧化损伤具有保护作用，并能减弱Hb释放和MetHb的生成量。

维生素C；红细胞；血红蛋白释放试验；过氧化氢；高铁血红蛋白

淀粉-琼脂糖混合凝胶电泳主要用来观察血红蛋白(hemoglobin，Hb)的电泳行为，试验时不需要制备红细胞裂解液，直接用全血电泳观察，大大提高了研究效率[1]。2007年，由包头医学院秦文斌带队的血红蛋白研究组在进行1例轻型β-地中海贫血患者的红细胞电泳过程中偶然发现了Hb再释放现象，依此创建了血红蛋白释放试验(hemoglobin release test，HRT)[2-4]，并推测HRT可能与Hb和红细胞膜之间的相互作用有关[5-6]。前期研究结果表明，过氧化氢处理红细胞后会增加Hb再释放[7]。维生素C是水溶性抗氧化物，本研究旨在通过HRT比较维生素C对过氧化氢氧化损伤的红细胞是否具有保护作用，并进一步探讨HRT可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血液标本 80份正常成人新鲜肝素抗凝静脉血，取自包头市第四医院检验科的健康体检者。本研究得到包头医学院伦理委员会审批，并在取血前与献血者签订了知情同意书。血样4℃保存，24h内检测。

1.1.2 主要仪器与试剂 水平电泳槽(北京六一，DYY-Ⅲ型)和稳压稳流电源(DYY-2C)为北京六一生产；高速离心机为德国Eppendorf公司产品；全波长多功能酶标仪为美国Thermo公司产品；17cm×17cm玻璃板等；淀粉、硼酸、Tris、EDTA、氨基黑、冰醋酸、乙醇、CCl4、30% H2O2等均为国产分析纯；琼脂糖为西班牙进口分装；维生素C注射液(250mg/mL)为瑞阳制药有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 红细胞悬液和溶血液的制备 按照本室常规方法制备红细胞悬液和溶血液[8]，将红细胞悬液分为两组，每组6份。维生素C保护组加入等体积浓度为0.625g/L 维生素C，对照组加入等体积生理盐水。2h后，两组分别加入0、2.5、5、10、20、40mL/L的H2O2溶液作用2h。

1.2.2 血红蛋白释放试验 按照本室常规方法配制淀粉-琼脂糖混合凝胶[8]，各样品红细胞悬液分别吸取10μL，加在1cm×0.2mm滤纸条上，并将滤纸条插入凝胶。第1次电泳120V通电65min，断电5min后再通电60min。泳毕，将凝胶板浸入氨基黑10B染色过夜，再用50mL/L冰醋酸溶液反复漂洗，观察结果并拍照。

1.2.3 红细胞相对溶解度测定 H2O2溶液作用红细胞2h后，经3000r/min离心5min，吸取50μL上清液，用生理盐水稀释6倍于540nm处测定吸光度值，以溶血液50倍稀释液的吸光度值为参照吸光值，计算各样品的相对溶解作用。相对溶解度=吸光值/参照吸光值×100%。

1.2.4 高铁血红蛋白含量测定 MetHb的测定采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，按说明书进行操作。

1.2.5 统计学处理 数据结果用平均数±标准差表示，所有数据采用Graphpad Prism 5.0软件处理，用Two-way ANOVA检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 维生素C组和对照组红细胞悬液的Hb再释放

随着H2O2浓度逐渐升高，对照组Hb再释放量逐渐增加，而维生素C保护组Hb再释放量很少，且再释放增加量不明显(图1、图2)。

VC1～VC6.维生素C保护组；C1～C6.对照组VC1-VC6.维生素C protection groups; C1-C6.Control groups

图1 不同浓度H2O2处理维生素C保护组和对照组红细胞悬液的Hb再释放
Fig.1 Released Hb of erythrocytes treated by different concentrations of H2O2in vitamin C protection groups and control groups

VC1～VC6.维生素C保护组；C1～C6.对照组；与对照组相比，*P<0.001
VC1-VC6.Vitamin C protection groups; C1-C6.Control groups；Compared with the control groups,*P<0.001

图2 凝胶电泳图谱中释放Hb的半定量分析
Fig.2 Semi quantitative analysis of released Hb in gel electrophoresis

2.2 红细胞相对溶解度测定

2.2.1 参照吸光值 将溶血液稀释50倍，并测出540nm处的吸光值，取平均值0.623做为参照吸光值(表1)。

2.2.2 不同浓度过氧化氢处理后对红细胞膜的作用 不同浓度H2O2处理维生素C保护组和对照组，结果显示，维生素C保护组破膜程度与对照组组比较，P<0.001，差异极显著。两组随H2O2浓度增大，破膜程度均依次增强，但维生素C保护组破膜率远小于对照组，当H2O2浓度达到4%时，维生素C 保护组相对溶解度为9%，而对照组达到18.9%(图3)。

表1 参照吸光值Table 1 The standard OD

与对照组相比，*P<0.001
Compared with the control groups,*P<0.001

图3 不同浓度H2O2处理后红细胞的相对溶解度
Fig.3 The relative solubility of erythrocytes after H2O2treatment

2.3 不同浓度过氧化氢处理后高铁血红蛋白(MetHb)含量的变化

不同浓度H2O2处理维生素C保护组和对照组红细胞悬液，测定各管MetHb含量，结果显示维生素C保护组MetHb含量明显低于对照组；对照组H2O2作用后的5份样品MetHb生成量均高于无H2O2作用样品，P<0.05，有显著性差异。不同浓度H2O2作用时，维生素C组内6份样品之间比较，P=0.1785，MetHb生成量变化不显著(图4)。

与对照组相比，*P<0.05
Compared with the control groups,*P<0.05

图4 不同浓度H2O2处理红细胞后高铁血红蛋白含量的变化
Fig.4 Changes in the content of MetHb after treatment with different concentrations of H2O2

3 讨论

红细胞血红蛋白释放试验(HRT)是将未裂解的完整红细胞加在淀粉-琼脂糖混合凝胶中进行电泳，一次通电完成电泳，此时有血红蛋白(Hb)释放出来，称为“初释放”；如果在电泳释放过程中进行“断电-再通电”，又会有Hb从原点释放出来，称为“再释放”。正常情况下，初释放时，红细胞内的大部分Hb都释放出来，残留较少；再释放时，残留Hb再次离开红细胞，出现新的Hb区带[3-8]。试验过程中，本研究组将这一技术不断发展，并应用于临床病例的研究，比较了多种疾病及手术前后血液中红细胞HRT结果的差异，证实很多患者均可以出现Hb再释放增加。维生素C是血浆中最有效的抗氧化剂，通过还原作用一方面可以直接与氧自由基作用，清除氧自由基的毒性；另一方面，它作为供氢体，使被氧化的维生素E和巯基恢复为还原型，发挥了间接抗氧化作用。本研究首次将HRT应用于观察抗氧化物对红细胞氧化损伤的保护作用，当维生素C存在时，能够明显降低H2O2对红细胞造成的氧化损伤，导致Hb再释放量降低。HRT中释放的Hb是与膜结合的Hb[7]，维生素C的存在可以保护膜的完整性，降低Hb与膜的结合，因此降低了Hb的再释放。研究提示，HRT是一种快速、简单的方法，可以将其应用于检测各种抗氧化剂对红细胞膜的保护作用。

血红蛋白是由4个亚基和4个卟啉环组成的复杂蛋白质，其卟啉环中的二价铁在氧化剂存在条件下会被氧化成三价铁，使Hb变为无载氧活性的高铁血红蛋白(MetHb)。在正常的生理条件下,人血红细胞拥有一套完整的抗氧化系统,包括超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),谷胱甘肽过氧化物酶(GSHpx)等组成的抗活性氧酶系统和维生素E、维生素C、谷胱甘肽等非酶抗氧化剂[9]。当Hb被氧化成MetHb时，红细胞中的抗氧化系统就会产生一系列的消除Hb氧化变性的作用[10]。研究结果显示，不同浓度H2O2作用时，维生素C保护组中，MetHb含量均低于对照组，但MetHb含量未表现与H2O2浓度相关，可能与H2O2浓度选取范围有关。说明在红细胞悬液中加入维生素C促进了三价铁向二价铁转化，且当氧化剂浓度在一定范围内维生素C对Hb的保护作用不受氧化剂浓度的影响。HRT中维生素C保护组Hb再释放增加量不明显，提示MetHb产生后，是否更易与膜结合，推测Hb再释放量增加可能与MetHb增加有关，具体机制还有待于进一步研究。

[1] 李嘉欣，苏 燕.红细胞血红蛋白释放试验的临床研究进展[J].动物医学进展，2014，35(10): 104-107.

[2] 秦文斌，高丽君，苏 燕，等.血红蛋白释放试验与轻型β-地中海贫血[J].包头医学院学报，2007，23(6): 561-563.

[3] Su Y,Shao G,Gao L,et al.RBC electrophoresis with discontinuous power supply-a newly established hemoglobin release test[J].Electrophoresis,2009,30(17): 3041-3043.

[4] Su Y,Qin W.Protein electrophoresis: Methods in Molecular Biology：Interactions of Hemoglobin in Live Red Blood Cells Measured by the Electrophoresis Release Test[M].New York: Humana Press,2012.

[5] 魏春华，苏 燕，杨 丽,等.不同的红细胞破膜方法对血红蛋白A2现象的影响[J].包头医学院学报，2011，27(4): 1-2.

[6] Su Y,Gao L,Qin W.Interactions of hemoglobin in live red blood cells measured by the electrophoresis release test[J].Meth Mol Biol,2012,869: 393-402.

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Protective Effect of Vitamin C on Oxidative Damage to Erythrocytes by Using Hemoglobin Release Test

LI Jia-xin1,XIE Cai-xia1,QIAN Duo2,SU Yan1

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BaotouMedicalCollege,Baotou，InnerMongolia，014060,China;2.ClinicalLaboratoryofTheFourthHospitalofBaotou,Baotou,InnerMongolia，014030,China)

In order to study the protective effect of vitamin C on the oxidative damage to erythrocytes，the final concentrations of 0,2.5,5,10,20，40mL/L hydrogen peroxide(H2O2) solution were used to treat same volume vitamin C treated erythrocyte suspension(vitamin C protection groups) and vitamin C untreated erythrocyte suspension (control groups).The relative solubility and met-hemoglobin(MetHb) content were measured,and the release of hemoglobin(Hb) was compared by hemoglobin release test(HRT).The results showed that the Hb release quantity and the relative solubility of vitamin C protection groups were significantly lower than those in control groups (P<0.001),although the MetHb lower than the control groups(P<0.05),it has no correlation with the concentration of H2O2.It showed that vitamin C has protective effects on erythrocyte membrane oxidation damage,and can decrease the amount of Hb release and MetHb formation.

vitamin C; erythrocyte; hemoglobin release test; hydrogen peroxide; met-hemoglobin

2015-07-30

国家自然科学基金项目(81160214)；内蒙古自然科学基金项目(2010BS1101)；内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY14265)；秦文斌科技教育基金项目(201309)；内蒙古卫生厅科技计划项目(2010056)

李嘉欣(1982-)，女，辽宁鞍山人，讲师，硕士，主要从事血液保护方面研究。*通讯作者

S852.33

A

1007-5038(2016)01-0022-04