高效液相色谱法同时测定壮骨方煮散中朝藿定C和淫羊藿苷含量

田元春，李双蕾，邓紫娉，吴丽如，王嘉俊

（广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

高效液相色谱法同时测定壮骨方煮散中朝藿定C和淫羊藿苷含量

田元春，李双蕾，邓紫娉，吴丽如，王嘉俊

（广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

目的 建立同时测定壮骨方煮散中抗骨质疏松有效成分朝藿定C和淫羊藿苷含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为Plastisil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），以乙腈－水（27∶73）为流动相，流速为1.0 mL／min，检测波长为270 nm，柱温为30℃。结果 朝藿定C进样量在0.050～2.016 g范围内与峰面积线性关系良好（r＝0.999 9），淫羊藿苷进样量在0.032～1.280 g范围内与峰面积线性关系良好（r＝0.999 9）；朝藿定C和淫羊藿苷平均加样回收率分别为98.94%和100.99%，RSD分别为1.69%和1.07%（n＝6）。结论 该方法简便，重复性和稳定性良好，适用于壮骨方煮散中朝藿定C和淫羊藿苷的质量控制。

壮骨方煮散；朝藿定C；淫羊藿苷；高效液相色谱；含量测定

壮骨方煮散为治疗骨质疏松、防治低骨量的有效验方，由淫羊藿、黄芪、丹参、杜仲、山药、三七等中药材组方，具有益肾填精、活血化瘀、通络止痛之功效[1]。淫羊藿为方中君药，所含淫羊藿黄酮类化合物具有较强的抗骨质疏松作用[2]。淫羊藿中的黄酮类化合物主要有淫羊藿苷、朝藿定 C、朝藿定 A、朝藿定 B、宝藿苷Ⅰ等[3]。2010年版《中国药典（一部）》收载的淫羊藿药材有4种基源，其质量受物种来源、产地、用药部位、采收期和炮制方法等因素影响，目前市售淫羊藿药材中淫羊藿苷的含量差异较大，部分低于药典标准，而朝藿定C含量普遍较高[4－6]。为此，笔者建立了测定壮骨方煮散中的抗骨质疏松主要有效成分朝藿定C和淫羊藿苷含量的高效液相色谱(HPLC)法，为其质量控制、优化工艺研究提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC－20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司)，包括SPD－20A紫外检测器，LC－Solution色谱工作站；GH－252型分析天平（广州市艾安得仪器有限公司）；SimplicityTM型超纯水系统（Millipore公司）；KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

朝藿定C对照品（供含量测定用，成都曼斯特生物科技有限公司，批号为 MUST－15040715，纯度为98.17%）；淫羊藿苷对照品（供含量测定用，中国食品药品检定研究院，批号为 MUST－15052801，纯度为99.97%）；乙腈（色谱纯，美国 DIKMA公司，批号为70109），甲醇（色谱纯，美国 DIKMA公司，批号为70112），水为超纯水；壮骨方煮散和阴性样品（按壮骨方煮散处方中所有药味缺淫羊藿药材进行制备）均由广西中医药大学第一附属医院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Plastisil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保护柱：EasyGuard C18柱（10 mm×4 mm，5 μm）；流动相：乙腈－水（27∶73）；柱温：30℃；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL／min。理论板数按淫羊藿苷峰计应不低于1 500。

2.2 溶液制备

壮骨方煮散提取液：按照处方称取药材饮片，混合粉碎，加水常温浸泡30 min，煎煮保持微沸30 min，趁热过滤，滤液浓缩定容至100 mL，冷却即得。

对照品溶液：称取朝藿定C对照品和淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.252 g／L和0.160 g／L的单一成分对照品贮备液。取上述对照品贮备液各2 mL，置同一5 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，制成含朝藿定C 100.8 μg／mL和淫羊藿苷64.0 μg／mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：精密吸取煮散提取液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇约4 mL，超声提取30 min，取出，放至室温，加甲醇定容至刻度，离心（3 500 r／min）5 min，取出；精密吸取上清液2 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按煮散提取制备方法制备缺淫羊藿药材的壮骨方煮散阴性对照提取液，按供试品溶液方法制备，即得。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。朝藿定C、淫羊藿苷的保留时间分别为11.3 min和14.0 min，分离度＞1.5，阴性对照品无干扰。见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：分别精密吸取混合对照品溶液0.5，1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(A)对进样质量(C，μg）进行线性回归，得朝藿定C与淫羊藿苷线性回归方程分别为：A＝2×106C－23 799(r＝0.999 9，n＝6)和 A＝2× 106C－24 491(r＝0.999 9，n＝6)，进样质量线性范围分别为0.050～2.016 μg和0.032～1.280 μg。

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，按2.1项色谱条件测定，记录峰面积。结果朝藿定C峰面积的 RSD为0.13%(n＝6)，淫羊藿苷峰面积的 RSD为1.12%(n＝6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于室温放置0，2，4，8，12，24 h，按2.1项色谱条件进样10 μL测定，记录峰面积。结果朝藿定C、淫羊藿苷峰面积 RSD均为1.35%(n＝6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一批壮骨方煮散提取液，依法平行制备6份供试品溶液，按2.1项色谱条件进样10 μL测定，计算含量。结果朝藿定C、淫羊藿苷含量的 RSD分别为1.70%和1.87%（n＝6），表明该方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取6份已知朝藿定C和淫羊藿苷含量的煮散样品，加入等量的朝藿定C和淫羊藿苷对照品，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，进样10 μL测定，计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

分别取3个批次煮散提取液，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，进样10 μL，测定，记录峰面积，计算含量。结果见表2。

3 讨论

中药煮散是将中药材粉碎成一定粒度与水共煎、去渣取汁制成的液体制剂，吸收快、起效迅速，与传统饮片汤剂相比，有节省药材及能源、煎煮率高等独特优势，在目前药材资源匮乏、药价上涨明显的情况下，推广使用中药煮散对于现代经济和社会效益都意义重大[7]。

壮骨方煮散为临床验方，组方滋肾与益气活血并举，补气与养血通络互存，虚实共治，补而不腻邪，通而不伤络，共达益肾填精、活血化瘀、通络止痛之效。淫羊藿为方中君药，淫羊藿中多种黄酮成分具有抗骨质疏松活性，如淫羊藿苷、淫羊藿苷元、淫羊藿定A、淫羊藿定B和淫羊藿定C等[8－9]，5种单体均有增加细胞基质钙及促进体外培养的成骨细胞增殖和矿化作用[10－11]。淫羊藿黄酮可改善模型动物的骨密度和骨生化指标[12]，促进试验性骨质疏松性骨折修复[13]，提高骨质疏松症患者的骨密度疗效，且能改善骨质疏松症中医证候及主要症状[14]。淫羊藿总黄酮代谢产物也具有促进骨形成活性[15]。

在检测波长选择时，经全波长扫描，朝藿定C、淫羊藿苷在270 nm波长处均有较大吸收，根据药典及文献[4－5，16]，确定检测波长为270 nm。在流动相选择时，比较了甲醇－水溶液系统和乙腈－水溶液系统，乙腈－水溶液系统基线平稳、柱压低，通过调整乙腈和水的比例，朝藿定C和淫羊藿苷与其他成分得到良好分离。在柱温选择时，分别考察了不同柱温（25，27，30，32，35℃）对分离效果的影响，柱温30℃时朝藿定C和淫羊藿苷分离效果良好，保留时间适宜。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

表2 样品含量测定结果（n＝3）

综合分析，所建立的HPLC法操作简便、快速、灵敏、准确，可用于壮骨方煮散的质量控制和进一步的工艺优化。

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Content Determination of Epimedin C and Icariin in Zhuanggufang Zhusan by HPLC

Tian Yuanchun，Li Shuanglei，Deng Zipin，Wu Liru，Wang Jiajun
（The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，China 530023）

Objective To establish an HPLC method for the content determination of active ingredients（epimedin C and icariin）of antiosteoporosis in Zhuanggufang Zhusan.M ethods HPLC was used with the Plastisil C18column（250 mm × 4.6 mm，5 μm），acetonitrilewater（27∶73）as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL／min，the detecting wavelength of 270 nm，and the column temperature at 30℃.Results The good linear was over the range of 0.050 － 2.016 μg for epimedin C（r＝0.999 9）and the average recovery（n＝6）was 98.94% with RSD of 1.69%；the good linear was over the range of 0.032－1.280 μg for icariin（r＝0.999 9）and the average recovery（n＝6）was 100.99% with RSD of 1.07%.Conclusion The method is simple and with high repeatability and stability，which can be used for the quality control of Zhuanggufang Zhusan.

Zhuanggufang Zhusan；epimedin C；icariin；HPLC；content determination

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2016)22－0064－03

田元春，大学本科，主任药师，研究方向为临床药学、医院药学，（电话）0771－5840015（电子信箱）tianyc1989＠163.com；李双蕾，大学本科，主任医师，教授，主要从事临床内分泌及代谢性疾病工作，本文通讯作者，（电话）0771－5848628（电子信箱）lslei66＠126.com。

2016－08－11)

广西科学研究与科技开发计划科技攻关项目，项目编号：桂科攻14124004－1－26。