表没食子儿茶素没食子酸酯对X线照射大鼠肺损伤病理形态、M M P－1及T IM P－1蛋白表达的影响

王祥财，梁雷锋，施华球，许明君，王钇力，衷敬华

（1.赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000； 2.广西壮族自治区玉林市第一人民医院，广西 玉林 537000）

表没食子儿茶素没食子酸酯对X线照射大鼠肺损伤病理形态、M M P－1及T IM P－1蛋白表达的影响

王祥财1，梁雷锋2，施华球1，许明君1，王钇力1，衷敬华1

（1.赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000； 2.广西壮族自治区玉林市第一人民医院，广西 玉林 537000）

目的 观察表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对放射性肺损伤大鼠肺组织病理形态及MMP－1和TIMP－1蛋白表达的影响，评价EGCG对放射性肺损伤的防治作用。方法 将雄性Wistar大鼠108只随机分为6组，即正常对照组，放射模型组，大、中、小剂量儿茶素组和泼尼松组。除正常对照组外，其余组均给予X线照射，单次30 Gy。每组分别于照后第14天、30天、60天随机处死大鼠，取左肺组织常规方法制成石蜡切片，苏木素－伊红(HE)染色观察病理形态变化，采集右肺中叶组织，免疫组化法观察肺组织MMP－1和TIMP－1蛋白的表达。结果 HE染色显示，大、中剂量儿茶素组肺泡充血、渗出、出血及炎性细胞浸润程度均轻于放射模型组。免疫组化结果显示，与正常对照组比较，14～60 d放射模型组肺组织MMP－1和TIMP－1蛋白表达相应增高，MMP－1／TIMP－1比例增大。与放射模型组比较，中、大剂量儿茶素组MMP－1和TIMP－1蛋白表达明显减少（P＜0.05），MMP－2／TIMP－2始终处于相对平衡状态，小剂量儿茶素组MMP－1和 TIMP－1蛋白表达增多，与放射模型组比较无明显差异（P＞0.05）。结论 放射性肺损伤的病理变化与MMP－1和TIMP－1表达的平衡失调有关，EGCG对放射性肺损伤大鼠有保护作用，其机制可能为通过抑制MMP－1和TIMP－1蛋白表达，从而维持MMP－1／TIMP－1比例的平衡。

表没食子儿茶素没食子酸酯；放射性肺损伤；苏木素－伊红染色；MMP－1蛋白；TIMP－1蛋白

放射性肺损伤是胸部肿瘤行放射治疗时容易出现的常见不良反应，因其发生率高，可造成严重不良事件，且临床尚无特效治疗手段，故关于放射性肺损伤保护剂的研究成为目前放射治疗领域的研究热点。放射性肺损伤包括初期的炎症改变及后期纤维化变化。纤维化的病理特点主要是胶原蛋白的增生，目前认为，MMP－1／TIMP－1是调控细胞外基质胶原蛋白增生的主要酶系之一。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶提取的主要成分，研究证实其在抗炎、防辐射等方面具有一定作用，但将EGCG应用在放射性肺损伤方面的研究却鲜见，具体机制也尚不明确。本研究中应用EGCG对放射性肺损伤大鼠肺组织进行保护，观察肺病理形态及MMP－1和TIMP－1蛋白的表达，以评价EGCG对放射性肺损伤的防治作用，为进一步探讨其可能的作用机制提供试验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药物与动物

儿茶素（EGCG，批号为Z20130056)购自江西农业大学。雄性Wistar大鼠108只，平均体质量（200±20）g，动物合格证编号为SCXK2013－026，随机分笼，每笼6只，由动物室统一喂养。

1.2 动物分组

将108只Wistar大鼠随机均分为6组，即正常对照组、模型组、儿茶素大剂量[200 mg／（kg·d）]组、中剂量[100 mg／（kg·d）]组及小剂量[50 mg／（kg·d）]组和泼尼松[6.72 mg／（kg·d）]组。正常对照组大鼠给予0.9%氯化钠注射液腹腔注射；放射性肺损伤模型组大鼠给予X射线照射进行造模；儿茶素大剂量组大鼠给予X射线照射进行造模，1周后予以儿茶素（200 mg／kg）进行灌胃，1次／天；儿茶素中剂量组大鼠给予X射线照射进行造模，1周后予以儿茶素（100 mg／kg）进行灌胃，1次／天；儿茶素小剂量组大鼠给予X射线照射进行造模，1周后予以儿茶素（50 mg／kg）进行灌胃，1次／天；泼尼松组大鼠给予X射线照射进行造模，1周后予以泼尼松（6.72 mg／kg）灌胃，1次／天。

1.3 动物模型制作

除正常对照组外，其余各组均用X射线照射进行放射性肺损伤模型建立。用23EX型直线加速器（美国瓦里安公司）产生的6 MV X射线，等距离照射大鼠全肺，照射野上界平大鼠腋窝，下界平胸骨剑突，照射面积约4.5 cm×4 cm，大鼠全身其余部分用10 cm后挡铅屏蔽。源皮距为100 cm，剂量率为240 cGy／min，照射剂量为30 Gy[2]。照后1周，各治疗组开始灌胃给药，正常对照组及模型组灌胃给予等体积的蒸馏水。

1.4 标本获取和处理

大鼠处死时采用乙醚麻醉，迅速切取肺脏标本置冰盐水中充分洗涤。

1.5 观察项目

病理观察（HE染色）：在 X线照射后不同时间点（分别在第14天、30天、60天），在各组随机抽取6只大鼠，用2%戊巴比妥钠30 mg／kg腹腔内注射，麻醉后开胸暴露肺，取肺组织置10%中性缓冲福尔马林溶液中固定，用常规方法制成石蜡切片，经苏木素－伊红（HE）染色。

图像分析：应用图像分析仪测组织切片中肺泡壁厚度、肺间质、弹力纤维、肺内成纤维细胞胶原含量。

免疫组化：分别在第14天、30天、60天，在各组随机抽取 6只大鼠，取大鼠右肺中叶，10%福尔马林溶液固定24 h，石蜡包埋，5 μm连续切片，免疫组化采用S－P检测肺组织MMP－1及TIMP－1蛋白表达。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(s)表示，采用析因分析，多重比较采用LSD分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学观察（HE染色）

各组大鼠肺组织石蜡切片，分别行HE染色观察动物肺组织一般病理学改变。正常对照组：肺内结构正常。放射模型组：第14，30，60天，肺泡内炎性细胞由少逐渐增多，再逐渐减少，纤维细胞逐渐增多，胶原纤维沉积而表现肺纤维化，大、中剂量儿茶素组肺泡充血、渗出、出血及炎性细胞浸润等方面程度较轻，炎性细胞、纤维细胞数目明显少于放射模型组。泼尼松组炎性细胞、纤维细胞数目少于放射模型组，中、大剂量儿茶素组与泼尼松组比较，炎性程度明显较轻。见图1。

图1 照射60 d各组大鼠肺组织HE染色结果（×400）

表1 不同时点各组大鼠肺组织MMP－1表达量比较（s，n＝18）

表1 不同时点各组大鼠肺组织MMP－1表达量比较（s，n＝18）

注：与放射模型组比较， P＜0.05， P＜0.01。表2同。

组别正常对照组放射模型组泼尼松组中、高剂量儿茶素组小剂量儿茶素组平均表达量6.32±2.25 96.08±4.15 49.44±5.30 35.59±4.84 64.55±6.13 14 d 4.35±4.01 57.12±4.54 40.64±5.17 25.54±5.35 46.59±5.15 30 d 3.45±4.02 76.73±6.22 45.62±5.12 28.67±0.11 57.64±5.18 60 d 4.27±4.28 83.58±3.19 58.58±4.18 34.47±5.10 66.79±5.11

表2 不同时点各组大鼠肺组织TIMP－1表达量比较（s，n＝18）

表2 不同时点各组大鼠肺组织TIMP－1表达量比较（s，n＝18）

组别正常对照组放射模型组泼尼松组中、高剂量儿茶素组小剂量儿茶素组14 d 5.35±4.01 42.14±2.24 24.44±4.47 21.43±3.45 34.59±5.15 30 d 5.43±4.42 42.22±4.22 25.52±5.55 22.47±4.11 38.64±5.18 60 d 5.27±4.48 53.35±5.133 29.54±4.58 24.42±4.10 42.79±4.11平均表达量5.32±5.23 56.58±5.12 27.88±4.30 24.54±2.44 42.45±5.43

2.2 大鼠肺组织MMP－1蛋白表达

第14天、30天、60天，放射模型组与正常对照组比较，大鼠肺组织中MMP－1均大量表达（P＜0.01）。中、大剂量儿茶素组大鼠肺组织中MMP－1表达均低于放射模型组（P＜0.01）；小剂量儿茶素组与放射模型组MMP－1表达差异不明显（P＞0.05）；泼尼松组也均低于放射模型组（P＜0.05）。详见表1。

2.3 大鼠肺组织TIMP－1蛋白表达

第14天、30天、60天，放射模型组与正常对照组比较，大鼠肺组织中TIMP－1均大量表达（P＜0.01）；中、大剂量儿茶素组大鼠肺组织中TIMP－1表达均低于放射模型组（P＜0.01）；小剂量儿茶素组与放射模型组比较，TIMP－1表达差异不明显（P＞0.05），泼尼松组也低于放射模型组（P＜0.05）。详见表2。

3 讨论

放射性肺损伤是胸部恶性肿瘤经放射治疗后引起的炎性反应，临床无特效药，常予激素对症处理，但不良反应大，故探索无毒、高效的放射性保护剂成为了临床研究的热点。

放射性肺损伤包括初期的炎症改变及后期纤维化变化。纤维化病理特点主要是胶原蛋白的增生，目前认为，MMP－1／TIMP－1是调控细胞外基质胶原蛋白增生的主要酶系之一。当发生放射性肺损伤时，肺胶原蛋白不断增加，从而刺激MMP－1的产生，以期降解胶原蛋白，但随着MMP－1产生的增加，也会引起TIMP－1的升高，以达到MMP－1／TIMP－1平衡。随着放射性损伤程度的加大，MMP－1不断产生，抑制MMP－1的TIMP－1不能随之继续产生，从而导致 MMP－1／TIMP－1失衡，最终导致纤维化。国内学者研究发现，MMP－1是放射性肺损伤中炎症和纤维化过程中的高风险因素[3]。Costa等[4]研究认为，MMP－1参与了放射性肺损伤中胶原蛋白的降解，在放射性肺纤维化中起着重要的调节作用。

本研究中发现，大、中剂量儿茶素组肺泡充血、渗出、出血程度均显著轻于放射模型组，炎性细胞和纤维细胞数目均明显少于放射模型组；与正常对照组比较，14 d至60 d放射模型组肺组织MMP－1和TIMPs蛋白表达相应增高，MMP－1／TIMP－1比例增大，MMP－1大量增多，反而抑制了正常胶原降解的正反馈，从而使胶原基质沉积增多，最终导致肺纤维化[5－7]。与放射模型组比较，中、大剂量儿茶素组MMP－1和TIMP－1蛋白表达明显减少（P＜0.01或 P＜0.05），MMP－1／TIMP－1始终处于相对平衡状态，从而利于胶原降解正反馈[8]。小剂量儿茶素组MMP－1和TIMP－1蛋白表达增多，与放射模型组比较差异不明显。说明中、大剂量儿茶素组对放射性肺损伤大鼠有一定的保护功能，其机制可能与其能调节大鼠肺组织MMP－1／TIMP－1比例始终维持平衡有关[9－12]。说明放射性肺损伤的纤维化过程是受复杂的网络调控机制决定，本研究结果提示，MMP－1／TIMP－1比例平衡是调节肺纤维化的重要因素之一。

我国是天然药物大国，茶叶在我国分布广泛，茶儿茶素作为茶叶的提取物，制作工艺成熟，价格低廉。故深入研究茶儿茶素等中药关于放射性肺损伤防护作用的基础理论，对于促进中医现代化具有重要意义，也为开发防护放射性损伤的中药制剂提供了新的思路[13－15]。

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Effects of EGCG on the Pathological Morphology and Expression of MMP－1，TIMP－1 Protein in Radiation－Induced Lung Injury of Rats

Wang Xiangcai1，Liang Leifeng2，Shi Huaqiu1，Xu Mingjun1，Wang Yili1，Zhong Jinghua1
（1.The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，GanZhou，Jiangxi，China 341000； 2.Yulin First People′s Hospital，Yulin，Guangxi，China 537000）

Objective Toobservetheeffect of epigallocatechin gallate（EGCG） on thepathologicalmorphology and expression of MMP－1，TIMP－1 protein in radiation－induced lung injury of rats，and to evaluate the effect of EGCG on prevention of radiation－induced lung injury.Methods 108 male Wistar rats were randomly divided into 6 groups：normal group，radiation model group，large，medium and small dose of EGCG group，prednisone group.Except for the normal group，the remaining groups were given X ray of 30 Gy dose.Rats were sacrificed randomly on 14，30 and 60 d after radiation；routine method of left lung tissue was made into paraffin sections；HE staining was used to observe the pathological morphological changes.The left lung tissue was made into paraffin sections by routine method；theexpression of MMP－1 and TIMP－1 protein in lung tissuewasobserved by immunohistochemicalmethod.Results HE staining showed that the degree of alveolus congestion，exudation，hemorrhage and infiltration of inflammatory cells in the large and medium dose EGCG group were lighter than that in the radiation model group.Compared with the normal control group，the expression of MMP－1 and TIMP－1 protein in lung tissue in the radiation model group was elevated and the ratio of MMP－1／TIMP－1 was increased on 14－60 d.Compared with the radiation model group，the MMP－1 and TIMP－1 protein expressions in the large and medium dose EGCG group were significantly decreased（P＜0.05），and the MMP－2／TIMP－2 remained in relative equilibrium state；in small dose EGCG group，the expression of MMP－1 and TIMP－1 protein increased，and there was no significant difference compared with the radiation model group（P＞0.05）.Conclusion The pathologic changes of radiation－induced lung injury are related to the imbalance of MMP－1 and TIMP－1 expression.EGCG has a protective effect on radiation－induced lung injury in rats，and its mechanism may be through inhibiting the expression of TIMP－1，MMP－1，in order to maintain the balance of MMP－1／TIMP－1 ratio.

epigallocatechin gallate；radioactive lung injury；HE staining；MMP－1 protein；TIMP－1 protein

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2016)22－0026－04

王祥财（1968－），男，主任医师，副教授，硕士研究生导师，主要从事临床淋巴瘤、肺癌、肝癌、胃肠道恶性肿瘤的化学治疗及介入治疗，（电话）0797－8265619；衷敬华，博士研究生，主治医师，本文通讯作者，（电子信箱）zaijunhao2009＠126.com。

2016－08－18)

江西省卫生厅中药局基金项目，项目编号：2013A078；江西省教育厅青年科学基金项目，项目编号：GJJ12561。