大黄素治疗大鼠急性肝功能衰竭时核因子－ B的动态变化

于 盈，王凤玲

（浙江省台州市立医院感染内科，浙江 台州 318000）

大黄素治疗大鼠急性肝功能衰竭时核因子－ B的动态变化

于 盈，王凤玲

（浙江省台州市立医院感染内科，浙江 台州 318000）

目的 探讨大黄素治疗大鼠急性肝功能衰竭时大鼠肝脏中核因子－ B(NF－ B)的动态变化。方法 将SD大鼠随机分为健康对照组、肝衰竭模型组（ALF组）、大黄素治疗组。以 D－氨基半乳糖（D－Gal）建立大鼠急性肝功能衰竭模型，建模后12 h，大黄素治疗组腹腔注射10 mg／kg大黄素，2次／天。ALF组及大黄素治疗组分别在建模后24，72，120，168 h随机各取6只大鼠，取门静脉血查肝功能，10%甲醛液固定肝组织，免疫组化检测NF－ B。结果 造模后24 h，大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬酸氨基转移酶（AST）明显升高，且显著高于健康对照组（以72 h为著），差异有统计学意义（t＝5.521，7.743，P＜0.01）；建模后72 h相同时点，ALF组大鼠肝功能指标均显著高于大黄素治疗组（P＜0.01）；建模后24 h，ALF组NF－ B表达高于健康对照组（q＝3.325，P＜0.01），其表达72 h达高峰，120 h后逐渐下降；建模后72，120，168 h大黄素治疗组与 ALF组的NF－ B表达水平比较，差异有统计学意义（q＝5.638，5.527，5.314，P＜0.01）。结论 大黄素对大鼠急性肝功能衰竭有保护作用，其机制可能与下调NF－ B的表达有关。

肝功能衰竭；急性；大黄素；核因子－ B；大鼠

肝功能衰竭是由多种因素引起的肝细胞合成、分泌及生物转化严重障碍临床综合征，患者以黄疸、肝性脑病、腹腔积液、凝血功能障碍等为主要临床表现。其包括急性、慢性和亚急性肝功能衰竭，其中急性肝功能衰竭（ALF）是由于肝脏功能急剧减退，导致以明显黄疸、凝血功能低下和肝性脑病为主要表现的综合征，是最严重的一种表现。ALF患者发病急，病情进展迅速，当前临床尚无特效治疗方法。大黄是临床使用较广泛的中药之一，其主要有效成分为大黄素，不少临床研究和试验研究发现，大黄素具有多种生物学作用，包括抗炎、肝功能保护、免疫调节等，也有不少学者采用大黄制剂防治肝癌、保护肝功能等[1－4]。细胞增殖S期会表达核因子－κB（NF－κB）蛋白，不少研究发现，NF－κB能参与细胞增殖过程，NF－κB的变化能直接反映细胞的增殖功能，因此可用来评价肝细胞的再生作用。本研究中拟通过建立ALF大鼠模型，采用大黄素干预，分析NF－κB变化，探讨大黄素对肝脏功能保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药、动物

1.1.1 仪器及试药

主要仪器包括全自动生化分析仪（济宁市润煤工矿物资有限公司）。主要试剂包括NF－κB一抗（广州泰诺迪生物科技有限公司）；D－氨基半乳糖（D－Gal，重庆医科大学化学教研室）；大黄素（广州泰诺迪生物科技有限公司，批号为110756－200110）。NF－κB免疫组化试剂盒（广州泰诺迪生物科技有限公司）。

1.1.2 试验动物及分组

研究符合动物试验伦理学原则。选取健康清洁级雄性SD大鼠（温州医学院实验动物中心，动物合格证编号为2010－04－12）54只，体质量180～220 g。按随机数字表法分成健康对照组（6只），肝功能衰竭模型组（ALF组，24只），大黄素治疗组（24只）。3组大鼠均给予相同喂养条件和饮食：温度18～26℃，相对湿度5% ～10%，噪声小于85 dB，每1 h通气换风8～12次，饲喂量5 g。术前12 h禁食，术前4 h禁饮。大黄素治疗组和ALF组分别于建模后24，72，120，168 h取6只大鼠，采集门静脉血标本，同时留取肝组织标本。

1.2 模型建立

准确称取 D－Gal 10 g，溶入0.9%氯化钠注射液100 mL中，采用1 mol／L NaOH调溶液pH至7.0，溶液最终浓度在10%。ALF组大鼠腹腔注射1.25 g／kg D－Gal溶液，健康对照组大鼠注射等量生理盐水。12 h后，大黄素治疗组大鼠腹腔注射 10 mg／kg大黄素，2次／天。健康对照组大鼠在给药24 h后留取静脉血，取肝组织。ALF组及大黄素治疗组分别在给药后24，72，120，168 h时取6只大鼠行腹腔麻醉，取静脉血，同时留取大鼠肝组织。静脉血离心取上清液，在－80℃冰箱保存；大鼠肝组织采用甲醛固定，行病理及免疫组化检测。

1.3 检测方法

全自动生化分析仪检测血清标本中肝功能指标变化，包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬酸氨基转移酶（AST）。甲醛固定肝组织，石蜡包埋切片，苏木素－伊红（HE）染色，在显微镜下观察肝组织病理学变化。

甲醛固定肝组织，脱水，检测NF－κB水平，严格按照试剂盒说明操作。采用苯基丁酸（PBA）为阴性对照，以出现棕黄色细胞核为阳性。采用Image－ProPlus 6.0图像分析，测量肝组织平均光密度 OD值，光密度OD＝积分光密度（IODSUM）／组织面积（Area SUM）。

1.4 统计学处理

采用 Microsoft Excel软件建立数据库，SPSS 18.0软件进行统计学分析。多样本计量资料比较采用 SNK法，组内不同时间点比较采用 LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALT与AST水平

血清ALT和AST经方差齐性检验，组间两两比有显著性差异（F＝36.28，P＜0.01）；建模24 h后，ALF组肝功能指标均显著上升，与对照组相比有显著性差异（t＝5.521，7.743，P＜0.01）；建模后24 h，ALF组和大黄素治疗组血清ALT和AST等差异不明显，建模后72 h达高峰。此后，大黄素治疗组ALT和AST显著下降，相同时间点，显著低于ALF组（P＜0.01）。ALF组和大黄素治疗组建模后120，168 h血清ALT和AST均持续下降。详见表1。

表1 各组大鼠不同时点肝功能变化（s，U／L，n＝6）

表1 各组大鼠不同时点肝功能变化（s，U／L，n＝6）

注：与健康对照组比较， P＜0.05；与 ALF组同时点比较，P＜0.05。

组别 时间健康对照组ALF组 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h大黄素治疗组 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h ALT 28.7±2.6 321.3±89.7 724.0±121.4 191.4±51.0 88.3±13.9 293.9±69.5 187.4±52.1 102.7±27.2 52.4±9.7 AST 76.4±5.2 575.5±117.3 223.2±73.1 171.7±53.9 150.5±38.7 535.3±110.9 179.5±71.5 110.3±25.6 75.7±15.1

2.2 肝组织病理学改变

HE染色结果表明，健康对照组大鼠肝组织结构完整，能清晰看到肝索。注射 D－Gal后，ALF组大鼠肝组织染色显示，肝小叶结构破坏，肝细胞大面积坏死。见图1和图2。

图1 健康对照组大鼠肝组织（HE染色，×400）

图2 ALF组大鼠肝组织（HE染色，×400）

2.3 肝组织NF－ B的表达

健康对照组 NF－κB不表达或有少量表达，24 h后，ALF组 NF－κB水平显著高于健康对照组（q＝3.325，P＜0.01），ALF组和大黄素治疗组NF－κB均在72 h达到最高，随后开始缓慢下降。72 h开始至168 h，大黄素治疗组肝组织NF－κB表达较ALF组明显减少（q＝5.638，5.527，5.314，P＜0.01）。详见表2。

表2 各组大鼠不同时点肝组织内NF－ B表达水平比较（s， g／mL，n＝6）

表2 各组大鼠不同时点肝组织内NF－ B表达水平比较（s， g／mL，n＝6）

注：与健康对照组相比， P＜0.05；与 ALF组同时点比较，P＜0.05。

组别 时间健康对照组ALF组 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h大黄素治疗组 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h NF－ B 0.038±0.004 0.121±0.020 0.201±0.032 0.109±0.007 0.092±0.006 0.113±0.014 0.172±0.025 0.074±0.006 0.053±0.006

3 讨论

急性肝功能衰竭最突出的表现是短时间内肝细胞变性、坏死等，炎性因子显著增加，由于ALF病情进展快，存在多种并发症，临床治疗难度较大，而且预后极差，死亡率很高，其治疗是研究的难点和重点。肝移植治疗肝功能衰竭较有效，但临床应用中由于供体缺乏、费用昂贵，无法推广采用[5－6]，故研究更加合理的中药治疗有重要现实意义。

大黄素是大黄主要有效成分之一，属于蒽醌类，又名朱砂莲甲素，提取出的大黄素常温下呈针状结晶状。近几年医学领域中对大黄素的研究较为广泛，当前的研究发现，大黄素具有多种生物学作用，包括肝细胞保护、抗炎、抗肿瘤作用等，有学者分析了大黄在急性胰腺炎中的应用，治疗前，两组患者淀粉酶、二胺氧化酶（DAO）等指标差异不明显，连续治疗1周，两组患者血淀粉酶、DAO等均显著下降，观察组血淀粉酶、DAO显著低于对照组（P＜0.05），故认为大黄能抑制钠离子和钾离子，促进上皮细胞离子主动运转，具有广泛抗菌、抗病毒的效果[7]。大黄素对机体具有双重调节作用，既能抑制T淋巴细胞增殖，减小脓毒血症阳性率，减小炎性因子过度释放，又能抑制不同有丝分裂刺激脾细胞增殖。

本研究中建立了大鼠急性肝功能衰竭模型，同时在建模72 h后注射大黄素，结果大鼠血清ALT及AST水平显著下降，且与肝衰竭模型组比较，差异有统计学意义，说明大黄素对肝功能有一定保护作用。在以往的研究中发现，大黄素能抑制炎性因子作用，减少内毒素血症，同时在清除氧自由基、减少炎性递质方面也有明显作用[8]。其他研究中还发现，注射大黄素后，体内炎性因子，如肿瘤坏死因子－α（TNF－α）、白细胞介素（IL）－6、IL－1等的分泌显著减少，故认为大黄素能减少肝细胞凋亡，减轻炎性反应[9]。本试验中，大黄素的肝保护作用可能与上述机制有关。

NF－κB为反映肝细胞增殖的重要蛋白质，细胞DNA的合成与NF－κB密切相关[10]。NF－κB对启动细胞增殖有重要作用，其表达量能直接反映细胞增殖和复制活跃程度，已成为反映细胞增殖效应的重要指标[11－14]。

本研究中观察了NF－κB水平的变化，结果显示，随着时间的推移，肝衰竭模型组大鼠肝组织的NF－κB水平上升，在72 h达到最高峰，随后逐渐下降，而采用大黄素处理后，NF－κB则明显下降，且下降趋势一直持续到建模后168 h，这种变化趋势与肝衰竭模型组存在明显差异。说明大黄素不仅会对ALT和AST产生影响，还会影响NF－κB的表达。提示大黄素可能通过抑制炎症细胞分泌和聚集减少NF－κB表达，进而发挥抗细胞凋亡作用。

综上所述，本研究中通过建立肝衰竭大鼠模型，同时注射大黄素进行治疗，分析大黄素对肝细胞增殖的影响，发现大黄素可能减少炎性因子的释放，抑制IKK细胞信号传导通路，进而达到抑制肝细胞凋亡的效果，也能为肝细胞再生提供微环境，这可能是其治疗肝功能衰竭的机制，对大黄素今后的应用提供了理论基础。

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Effects of Emodin on NF－κB in Rats with Acute Liver Failure

Yu Ying，Wang Fengling
（Department of Infectious Diseases，Taizhou Municipal Hospital，Taizhou，Zhejiang，China 318000）

Objective To explore the dynamic changes of NF－κB in the liver of rats treated with emodin in acute hepatic failure.M ethods SD rats were randomly divided into three groups：healthy control group，liver failure model group（ALF group），and emodin group.A rat model of acute liver failure was made by D－galactosamine（D－Gal）.12 h after the model was established，the emodin group received intraperitoneal injection of 10 mg／kg emodin twice daily.At 24，72，120 and 168 h after modeling，6 rats were randomly selected from the ALF group and the emodin group.The hepatic function was examined by portal vein blood.Liver tissue was fixed with 10% formalin，and immunohistochemistry was used to detect NF－κB.Results After 24 h of modeling，the levels of alanine aminotransferase（ALT） and aspartate aminotransferase（AST） in serum were significantly higher than those in the healthy control group，the difference was statistically significant（t＝5.521，7.743，P＜0.01）；after 72 h of modeling，the liver function of rats in ALF group was significantly higher than that of emodin group at the same time point（P＜0.01）；after 24 h of modeling，the expression of NF－κB in ALF group was significantly higher than that in healthy control group（q＝3.325，P ＜0.01），and reached the peak at 72 h，and decreased after 120 h.There were significant differences in the expression of NF－κB between the emodin group and the Alf group（q＝5.638，5.527，5.314，P＜0.01）at 72，120 and 168 h after modeling.Conclusion Emodin has protective effect on acute liver failure in rats，and its mechanism may be related to the down－regulation of NF－κB expression.

liver function failure；acute；emodin；NF－κB；rats

2016－07－13；

2016－08－11)

浙江省中医药科学研究基金计划项目，项目编号：2010ZA118；浙江省台州市椒江区科技计划项目，项目编号：112070。

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2016)22－0023－04