基于抗体生物类似药研发的生物制药共性技术服务平台合作模式研究

张 灿，董 丽

（沈阳药科大学工商管理学院，辽宁 沈阳 110016）

基于抗体生物类似药研发的生物制药共性技术服务平台合作模式研究

张 灿，董 丽

（沈阳药科大学工商管理学院，辽宁 沈阳 110016）

目的 观察多领域专业人员协同配合在生物类似药开发，尤其是单克隆抗体类似药研究开发中的作用。方法 通过抗体生物类似药在注册申报阶段与共性技术服务平台合作的内容和注意事项，分析研发企业与服务平台的合作模式。结果与结论 对于广大中小型生物药品研发企业，部分或全部业务委托合同研究组织不仅是一种经营现象，也是现代专业分工的必然选择。外包后，研发企业可集中精力于核心业务，这样更专业、更有效、更易成功，且一定程度上降低了成本。有助于中小型研发企业合理安排研发工作及加快申报。

生物类似药；单克隆抗体；合同研究组织；指导原则

汤森路透的数据显示，2013年至2015年全球销售额前10的药物中，生物药一直稳占7个席位且优势明显。近几年，随着多个“重磅炸弹”级生物药专利保护的到期，生物仿制药的优势将进一步凸显。Evaluatepharm预测，到2020年全球生物仿制药市场规模将增长至200亿美元，未来10年增长约90倍，年均复合增长率可达56%。早在2006年，欧盟就出台了关于生物仿制药研发生产的一系列指导原则[1－2]。世界卫生组织（WHO）在借鉴欧盟等地经验的基础上于2009年正式发布了《治疗性生物制品相似物评价原则》[3]。美国食品药物管理局（FDA）于2012年也出台了生物仿制药的3项指导原则[4]。2015年2月28日，国家食品药品监督管理总局（CFDA）发布了《生物类似药研发与评价技术指导原则（试行）》[5]，为我国生物类似药的研发和评价工作指明了方向。目前，专注生物医药、服务内容几乎覆盖研发各个环节的合同研究组织（contract research organization，CRO）如雨后春笋般应运而生。笔者以生物类似药的代表——单克隆抗体药物为例，尝试从注册申报阶段药学、药理毒理、临床等几个方面，对共性技术服务平台提供的服务内容、方式和注意事项进行简要分析，并对我国抗体类生物类似药的发展提出几点看法。

1 药学研究

1.1 上游构建

生产包括单克隆抗体在内的高特异性蛋白质类药物，多采用哺乳细胞系，因为哺乳动物细胞能够表达出药物活性必需的蛋白质折叠和糖基化，而糖基化是单克隆抗体药物发挥生物学功能的关键。因为糖基化的变化可能会导致抗体溶解度、稳定性、清除率和免疫原性的改变，并影响免疫因子的功能[6]。目前，几乎多数蛋白均采用中国仓鼠卵巢细胞（CHO）进行生产，原因是其具有适应性良好、基因操作简便、传染人类病毒的可能性低、能以高密度在生物反应器内生长、生产过程成熟而稳定等优点。

已上市单克隆抗体药物的序列可从公开发表的专利、文献等渠道获得。将确定的抗体轻重链可变区基因序列与人IgG 1／k恒定区基因序列按一定重组方式克隆到表达载体中，为分泌抗体细胞株的建立提供表达质粒；然后将质粒稳定转染至宿主细胞（多为DHFR二氢叶酸还原酶缺陷型的CHO细胞）；随后筛选出稳定传代并适用于长期生产的细胞株。

很多生物医药CRO公司都能够根据客户指定的靶点、序列或cDNA载体进行后续分子克隆，经过亚克隆和进一步分析，筛选得到用于抗体生产的高表达细胞系，并根据国内药品注册申报的要求，完成细胞系的生物安全性、遗传和表达稳定性等研究工作。

若此阶段与CRO公司合作，除了应关注生产细胞的抗体表达量、表达稳定性等指标外，还应以酶联免疫吸附试验(ELISA)或生物大分子相互作用分析(BIAcore)方法检测抗原抗体的亲和力，或是验证该抗体的结构特性，或是开展抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用／补体依赖性细胞毒性作用(ADCC／CDC)等生物活性研究，为准确仿制奠定基础。

1.2 细胞培养工艺

动物细胞的培养主要集中于细胞的代谢调控，反应器的操作模式和控制策略，无血清无蛋白培养技术，提高动物细胞的细胞密度和单抗的产率、生产出杂质蛋白含量低、容易分离纯化的人用单克隆抗体，并确保产品质量和过程工艺设计的一致性，减少工业化生产中的污染、提高自动化控制程度等。近年来，细胞生物反应器的工业化大规模培养，多采用流加培养方式；其过程优化建立在掌握细胞生长和单克隆抗体生成动力学基础之上，还依赖于对反应器更多培养参数的在线检测和自动控制。现有报道，生产细胞株的表达量已经很容易达到每日50 pg／cell以上，在流加培养中，最高产量可达27 g／L，且最高细胞密度超过2×108cells／mL[7]。生产细胞系所使用的培养基应根据其代谢特点和营养需求进行优化、定制，针对性地设计出培养和补料策略。

生物医药CRO公司能对培养基、接种密度、补料和生物反应器工艺控制策略进行优化，以最大限度地提高表达、增加工艺重现性并便于工艺放大；甚至还能根据客户要求进行工艺定制，以满足对产品质量的特殊要求。若此阶段与CRO公司合作，不仅应追求产量和生产力，还需关注工艺放大前后细胞活性、产物收率及产品质量等主要技术指标是否一致。

1.3 下游工艺

抗体生产过程中，从细胞培养上清液收获更多的抗体并进行纯化，是非常关键的一个部分，也是决定整个工艺流程费用的重要环节。抗体药物的纯化即抗体蛋白与杂质分离的过程，目的是优化产量、提高产品纯度。常用的纯化步骤及目的见表1。

由于不同抗体的特性和结构不同，纯化工艺层析的参数，如层析填料的选择、柱床直径、容积、柱高、动态载量、上样线速度、试剂选择、试剂pH调控等，都需要进行相应调整。由于可变参数太多，利用AKTA avant蛋白自动纯化系统进行Design of Experiments（DoE）实验设计，可在短时间内获得纯化工艺优化的信息和数据。

表1 常用纯化步骤及目的

生物医药CRO公司能根据不同抗体等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等不同的生化性质，同时还要考虑抗体的来源、发酵培养技术、发酵液蛋白浓度、宿主杂质、抗体批间差异、潜在污染寄病毒灭活等问题，制订相应的纯化策略。若此阶段与CRO公司合作，不仅应追求纯化工艺开发的速度、成功率和风险／成本效益分析，还需要结合质量分析的各种技术方法，关注聚合体的去处、电荷分布比的调整等杂质相关问题。

1.4 结构分析与确认

受制于对原研参照品种生产工艺信息获取的有限性，而生产过程又决定着产品的性质，故需全方位比对生物类似药和参照药。《生物类似药研发与评价技术指导原则（试行）》中明确指出，生物类似药候选药物的氨基酸序列原则上应与参照药相同[5]。因此，对结构的分析和确认是比对研究的基础，也是功能相似的基础。应采用适宜的分析方法，逐项分析表2中罗列的内容。

表2 结构分析的试验内容

生物医药CRO公司能依据相关指导原则的要求，如ICH Q6B，并结合国内药品注册申报的发展和经验，采用高效液相色谱（HPLC）仪、超高相液相色谱（UPLC）仪、基质辅助激光解吸生离和飞行时间质量分析（MALDI－TOF）仪、液相色谱串联质谱（LC－MS／MS）仪等设备，提供全套的生物类似药结构分析服务。由于进行结构分析的人员和技术设备专业性程度较高，此阶段不少生物类似药研发企业均选择与CRO公司合作，达到加快研发和申报速度、节约一定投资成本的目的。

1.5 其他特性

生物类似药和参照药的比对内容中，生物学活性、纯度和杂质也是重要组成部分，应采用先进的、敏感的方法进行试验研究。

生物学活性是表示产品产生特定生物学效应的具体量值[8]。作为抗体性能参数中的一个关键指标，建立切实可行的生物学活性测定方法，才能对抗体进行有效的质量控制。已上市抗体品种的生物活性测定多采用细胞法，观察不同抗体浓度下对细胞生长的抑制或促进作用，绘制出剂量－反应曲线，以半数有效浓度（EC50）或半数抑制浓度（IC50）的比值表示相对生物学活性。此外，还应对ADCC活性和CDC活性、抗体与抗原的亲和力（ELISA和 BIAcore方法）、与各种 Fc receptor（FcRn，Fcy，C1q等）的亲和力进行比对研究，这些试验不仅是质量对比研究的重要组成部分，还是药效学研究、抗原与抗体的结合能力、抗体的溶解性和聚集性、抗体吸引特殊免疫细胞能力等免疫学特性的证明和补充。

关于杂质，可分为产品相关杂质（product－related substances）和工艺相关杂质（process－relatedimpurities）[8]。产品相关杂质是在生产和／或贮存过程中产生的分子变异体，主要关注指标是纯度。检测抗体纯度现多采用分离效率更优的毛细管凝胶电泳（CE－SDS）法，以明确免疫球蛋白轻链和重链的含量、低相对分子质量杂质。此外，采用排阻高效液相色谱（SEC－HPLC）法可分离抗体和多聚体，明确高相对分子质量杂质。工艺相关杂质是指生产过程中产生的杂质，如细胞基质、细胞培养物、下游工艺产生的杂质。目前，针对外源DNA残留、CHO宿主DNA残留和蛋白A残留，均有商品化的试剂盒出售，开展相关检测较为简单。

生物医药CRO公司能根据生物类似药研发企业的要求，专门开展某项（或某些）试验的技术开发，建立具有良好专属性、特异性、准确性的分析方法，进而从多个角度对类似药进行鉴定、分析和评价。若此部分与CRO公司合作，除了考虑分析方法的先进性、分析内容是否全面、是否与参照药进行了充分的比对、是否关注了可能出现的新杂质以外，还应关注试验方法本身是否易于转移、是否稳定易重现等技术转移相关问题。

1.6 稳定性

药品稳定性是评价药品有效性和安全性的重要指标。稳定性研究是确定药品贮藏条件和使用期限的主要依据，也可以为药品的生产、包装、运输条件等提供科学依据。对生物类似药而言，其活性成分蛋白质的分子构型和生物活性的保持都依赖于各种共价和非共价的作用力，这些作用力的维持与其所处的微环境，如温度、氧化、光照、离子浓度和机械剪切力等存在密切的关系[9]，因此应开展严格全面的稳定性研究。稳定性研究可分为强力破坏试验、加速稳定性试验、长期稳定性试验、模拟实际使用或运输情况稳定性试验等。研究中，考察时间的长短及放置条件应充分考虑到今后的贮藏、运输及其使用的整个过程。考察项目设计要全面、合理，应包括在贮存时易变化，且有可能影响产品质量、安全性和（或）有效性的考察项目。

生物医药CRO公司能根据药典、指导原则的具体要求，对至少3批能代表生产规模情况的原液和成品进行研究，观察各种敏感贮藏条件的变化对类似药的外观、理化性质、蛋白纯度、蛋白含量、生物学活性、杂质、无菌试验和细菌内毒素等指标的影响。若此部分与CRO公司合作，除了关注稳定性研究的观察时间点设置，各个观察指标的变化趋势，了解外界条件变化对药品质量的影响之外，还应将效期相近的参照药纳入比较范畴[5]，得出更全面的研究数据。

1.7 包材相容性

成品的长期稳定性试验还需要结合品种上市时的最终包装材料进行相容性研究。这是为考察药品包装材料与药物之间是否发生迁移或吸附等现象，进而影响药物质量而进行的一种试验[10]。可靠、安全、使用方便是选择包装材料所要遵循的原则。单克隆抗体生物类似药内包材的选择，首先应遵循与原研参照药同类材质的原则，通常即注射剂级别的玻璃瓶和卤化丁基橡胶塞。其次，该直接接触药品的包材需符合相关标准，如中国食品药品检定研究院组织编写、2015年11月出版的《国家药包材标准》等，最好是拥有CFDA颁发的、仍在效期之内的《药品包装材料和容器注册证》或《进口药品包装用材料和容器注册证》。设计试验方案时，对于玻璃瓶，要考虑玻璃中的碱性离子是否会影响成品的pH；对于橡胶塞，要考虑胶塞中的添加物是否会影响成品的理化性质；对于注射液，则要考虑侧放、倒置等放置方式的变化。

生物医药CRO公司能根据药典、相关指导原则的具体要求，以实际使用情况进行模拟，使得药品与内包材进行充分接触，通过一系列的试验证实迁移或吸附是否存在，对包材的安全性作出合理评价。若此部分与CRO公司合作，至少应选用 1批玻璃瓶、3批胶塞和3批药品进行相容性试验研究，以考察包装对药品稳定性的影响。必要时还需进行方法学研究。

2016年8月10日，CFDA正式发布了《药包材药用辅料与药品关联审评审批有关事项的公告》，药品审批程序得到简化，直接接触药品的包装材料和容器由单独审批改为在审批药品注册申请时一并审批。这意味着，药物与包装相容性及浸出物和可提取物研究的重要性再次彰显出来，即对包材的质量要求已经达到对药品质量要求同等的水平上。过渡期（2017年12月31日）之后，包材相容性研究必将成为生物类似药注册申报资料中稳定性研究的重要组成部分。

2 临床前研究和临床试验

2007年版《药品注册管理办法》（局令第28号）规定，药物临床前研究的安全性评价研究必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（good laboratory practice，GLP），而药物临床试验必须执行《药物临床试验质量管理规范》（good clinical practice，GCP）。根据这2个规范的要求，开展试验的单位需要建立相应的人员系统、制度系统、设备系统、文件系统等，通过CFDA组织的认证检查，获得正式颁发的GLP／GCP证书后，方可开展动物试验和人体试验。

因此，研发企业一定会选择与专业的CRO公司合作完成这两部分极为关键的内容。研发企业需要在已有生物类似药的药学研究资料基础上，依据相关法规、技术指导原则的要求，结合参照品种已公开发表的各种信息，临床还要关注适应证本身治疗策略的发展，在CRO公司或临床专家的协助下，制订合理的试验方案，充分考察类似药与参照药在动物和人体内的作用，获得充分的、足够支持类似药获准上市销售的数据。

若前期药学研究结果显示，类似药与参照药无差异或差异很小，则临床前研究可仅开展药效学、药代动力学和免疫原性对比试验[5]。大多数试验可借鉴参照药的研究方法，同时增加适宜的比对即可。在免疫原性相关试验中，抗体检测必不可少，需要对出现的抗体进行筛选、确认、定性和定量研究，以明确抗体的形成是否影响了药效、毒性和药物暴露。若前期药学研究结果表明，类似药与参照药存在差异，则还需进行毒性对比试验。毒性评价的研究时间至少4周，通常不超过6个月[11]。

开展人体临床试验时，无论受试者是正常人还是患者，伦理、科学都是需要贯彻在试验全过程中的重要原则。同临床前研究一样，类似药与参照药的差异大小决定了试验内容。若前期药学和临床前研究结果表明，类似药与参照药无差异或差异很小，且临床药理学对比试验研究结果可预测其临床终点的相似性时，则结果可用于评判临床相似性[5]。《生物类似药研发与评价技术指导原则（试行）》于2015年初发布，受制于我国药品注册审评流程和时限，目前多数获得临床试验批件的生物类似药项目仍按照2007年版《药品注册管理办法》对临床试验的分类和要求开展试验。临床相似性的具体要求如何，确认临床相似性后将怎样减免类似药的临床，需要通过更多的项目一一证实。生物类似药的临床试验中，免疫原性的比对同样不可缺少。抗体有可能增加药物的清除和减少药物的摄取、改变组织分布、减少药物的药理学活性、减少清除和增加半衰期、与内源性蛋白质发生交叉反应等，这些都会影响药物的有效性和安全性。

3 讨论

同传统化学药相比，单克隆抗体药物具有相对分子质量大、结构复杂、空间结构严格、修饰形式多样、生产过程复杂等特点。基于这些特点，药学研究的每一个步骤都应该在充分借鉴参照药已公开资料及相关文献的基础上，采用合理的设计，结合先进的技术，不断优化各个环节，进行全面而透彻地研究。

汤森路透《2015年中国生物类似药发展报告》指出，全球生物类似药研发管线在数量上，单克隆抗体占1／3以上，而中国的这一数据则超过40%。根据IP多媒体系统（IMS）估计，2019年全球范围生物类似药市场份额将达到20%，规模将达240亿美元，其中欧盟市场容量106亿美元、中国达31亿美元。毫无疑问，生物类似药的研发已经成为全球生物制药企业新的关注点和增长点。截至2016年9月，印度、韩国、中国、俄罗斯、欧盟等多个国家或地区共同批准了9个原研抗体的27种生物类似药上市。其中批准最多的为Etanercept类似药，有8种；其次 Rituximab和 Infliximab类似药分别为5种。详见图1。就药监机构而言，可以看到，连要求一向严格的FDA也已批准2种抗体类似药上市。

图1 各国(或机构)抗体类似药批准情况

在中国，由于新药研发周期长、资金力量相对薄弱，成本承担能力有限，新药研发一直是药企的软肋，长期制约着国内制药产业的健康发展，生物药品更是如此。对广大中小型生物药品研发企业而言，部分或全部委托CRO不仅是一种经营现象，也是现代专业分工的必然选择。外包后，研发企业可以集中精力于核心业务，这样更专业、更有效、更易成功，且一定程度上降低了成本。

另一方面，伴随着专业技术的不断进步，CRO业务不断的拓宽深入，已经从最早的临床前研究、临床试验扩展到其上游、下游更加广泛的领域，如文中提到的细胞构建、制程开发、结构确认、注册申报等环节。在抗体生物类似药研发的过程中，研发企业选择在哪个部分与CRO合作，可以认为是关系到企业发展策略和产业化布局的重大决策，值得深度探讨。当然，CRO自身也需要不断进步，除了时刻关注专业领域的技术发展趋势、新药研发动态、各国法规变化之外，还需要通过国内外各种认证和检查，如 CNAS，CLIA，CAP，ISO 9001，AAALAC认证等，不断提高管理水平，以便为国内外客户提供高质量的研发服务。

[1]EMEA.Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology－derived proteins as active substances：quality issues[EB／OL].（2006）[2014－10－01].http：／／www.ema.europa.eu／docs／en_GB／document_library／Scientific_guidence／2012／05／WC500127960.pdf.

[2]EMEA.Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology－derived proteins as active substances：nonclinical and clinical issues.London[EB／OL].（2006）[2014－10－01].http：／／www.ema.europa.eu／docs／en_GB／documen t_library／Scientific_guidence／2009／09／WC500003920.pdf.

[3]WHO.Guidelines on Evaluation of Similar Biotherapeutic Products（SBPs） [EB／OL].（2009）[2014－10－01].http：／／www.who.int／biologicals／areas／biological－therapeutics／BIOTHERAPEUTICS_FOR_WEB_22APRIL2010.pdf.

[4]FDA.Guidance for Industry Quality Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Protein Product[EB／OL].（2012－02） [2014－10－01].http：／／www.fda.gov／downloads／Drugs／GuidanceComplicaceRegulatoryInformation／Guidances／UCM291134.pdf.

[5]国家食品药品监督管理总局.关于发布生物类似药研发与评价技术指导原则的通告（2015年第 7号）[EB／OL].http：／／www.sda.gov.cn／WS01／CL0087／115103.html.

[6]EMEA.EMEA Workshop on Biosimilar Monoclonal Antibodies [EB／OL].（2009－07－02）[2014－10－01].http：／／www.ema.europa.eu／docs／en_GB／document_library／Presentation／2009／11／WC500008483.pdf.

[7]Kunert R，Reinhart D.Advances in recombinant antibody manufacturing[J].Appl MicrobiolBiotechnol，2016，100（8）：3 451－3 461.

[8]ICH Q6b.Work Products.Quality Guidelines[EB／OL].http：／／www.ich.org／fileadmin／Public_Web_Site／ICH_Products／Guidel ines／Quality／Q6B／Step4／Q6B_Guideline.pdf.

[9]ICH Q5c.Work Products.Quality Guidelines[EB／OL].http：／／www.ich.org／fileadmin／Public_Web_Site／ICH_Products／Guidel ines／Quality／Q5C／Step4／Q5C_Guideline.pdf.

[10]YBB00142002－2015，药品包装材料与药物相容性试验指导原则[S].

[11]ICH S6.Work Products.Quality Guidelines.http：／／www.ich.org／fileadmin／Public_Web_Site／ICH_Products／Guidelines／Saf ety／S6_R1／Step4／S6_R1_Guideline.pdf.

Research on Cooperative Model of Service Towards Generic Technology in Biopharmaceutics Based on Biosimilar Monoclonal Antibody

Zhang Can，Dong Li
（School of Business Administration，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang，Liaoning，China 110016）

Objective To investigate the role of synergistic coordination in the development of biosimilar drugs，especially in monoclonal antibody－like drug research and development.Methods The cooperative model of R＆D enterprise and service platform is analyzed through the content and precautions of the cooperation between the biosimilar drug and the common technical service platform in the registration and declaration phase.Result and Conclusion For the majority of small and medium－sized bio－pharmaceutical R＆D enterprises，cooperation with contract research organization is not only a business phenomenon，but also the inevitable choice of modern professional division of labor.After outsourcing，R＆D enterprises can focus on their core business，which is more professional，more effective，easier to obtain results，more successful，and to a certain extent reduce costs.This can help small and medium R＆D enterprises with reasonable arrangements for R＆D work and speed up the registration and declaration.

biosimilar drug；monoclonal antibody；contract research organization；guideline

R95；F407.7

A

1006－4931(2016)22－0001－05

张灿，硕士研究生，研究方向为药事工商管理，（电子信箱）iwenwen＠sina.com；董丽，副教授，硕士研究生导师，研究方向为药事工商管理，本文通讯作者，（电子信箱）sydongli＠163.com。

2016－08－11)