慢性酒精暴露对SD大鼠急性脑缺血再灌注后早期海马齿状回颗粒下区神经干细胞的影响

陈钟樑 李正仪 李红蕾

慢性酒精暴露对SD大鼠急性脑缺血再灌注后早期海马齿状回颗粒下区神经干细胞的影响

陈钟樑 李正仪 李红蕾

目的 探讨慢性酒精暴露对SD大鼠急性脑缺血再灌注后早期海马齿状回颗粒下区（SGZ）神经干细胞（NSCs）的影响。方法 将SD大鼠随机分为正常组（自来水喂养）、对照组[单纯大脑中动脉闭塞（MCAO），自来水喂养]和酒精组（酒精暴露后MCAO，6%乙醇水溶液喂养）。正常组于饲养28d后灌注取脑，对照组、酒精组分别于造模后1、3、7d灌注取脑。切取以视交叉前缘至垂体后缘包含海马区厚约4mm的组织块进行石蜡包埋、切片、HE染色、巢蛋白（Nestin）染色处理；使用图像分析系统采集图像，计算并比较每张切片Nestin阳性细胞数。结果 HE染色可见对照组、酒精组造模后1d脑组织开始出现神经元损伤，造模后3d达到高峰，造模后7d开始恢复，且酒精组更为严重；正常组未见神经元损伤。Nestin染色可见对照组造模后1d SGZ Nestin阳性细胞开始增多，造模后7d达到高峰；酒精组造模后1d SGZ Nestin阳性细胞开始增多，3d达到高峰，造模后7d明显回落；正常组SGZ可见少量散在分布的Nestin阳性细胞。酒精组Nestin阳性细胞的数量明显少于对照组（P＜0.05）。结论 慢性酒精暴露可明显抑制MCAO后早期内源性NSCs增殖，抑制损伤后神经组织自身的修复，从而导致缺血性脑卒中的预后不良。

慢性酒精暴露 大脑中动脉闭塞 神经干细胞

研究表明缺血性脑卒中可激活内源性神经干细胞（neural stem cells，NSCs）增殖，并诱导其迁徙、分化，从而促进脑卒中后的神经再生与功能恢复[1]。有文献报道长期大量饮酒是脑卒中的常见病因之一，是增加脑卒中后长期病死率的独立危险因子[2]。酒精中毒可能会影响血脂、血压、红细胞、血小板功能、脑局部血流量、心律失常、β-内啡肽和镁离子等，从而间接促使脑卒中的发生[3-4]。然而目前对脑卒中后影响机制尚不清楚，故本实验拟通过研究慢性酒精暴露对大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后早期内源性NSCs增殖的影响，进一步阐明长期大量饮酒对大鼠MCAO后的影响机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料 健康、雄性、清洁级SD大鼠42只，鼠龄2个月，体重（200±10）g，由西安交通大学医学实验动物中心提供。75%医用乙醇、10%水合氯醛和4%多聚甲醛，由西安交通大学医学试剂科提供；兔抗大、小鼠Nestin蛋白多克隆抗体，由北京博奥森生物技术有限公司提供；SAP法检测试剂盒，由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将42只SD大鼠随机分为正常组6只、对照组（单纯MCAO组）18只和酒精组（酒精暴露MCAO组）18只；对照组、酒精组大鼠再分为造模后1、3、7d等3个亚组，每个亚组6只。

1.2.2 动物模型建立 （1）慢性酒精暴露模型的制作：以6%乙醇水溶液作为饮水的唯一来源饲养28d，制作慢性酒精暴露模型；而对照组、正常组均以自来水喂养。（2）MCAO模型的制作：采用改良线栓法制作MCAO模型[5]，造模成功的大鼠左眼虹膜颜色变浅、眼裂变小、瞳孔缩小，右侧偏瘫以上肢为甚，提尾悬拉后出现向右旋转。

1.2.3 术后评分 采用Zea-longa的5级4分法进行神经系统缺损程度评分，即无神经功能缺损症状为0分；轻微神经功能缺损，不能完全伸展右侧前爪为1分；中度局灶性神经功能缺损，向右侧转圈为2分；重度局灶性神经功能缺损，向右侧倾倒为3分；不能自发行走，意识水平下降为4分。实验大鼠评分均≥2分。

1.2.4 标本取材与固定 正常组于饲养28d后灌注取脑，对照组、酒精组3个亚组分别于造模后1、3、7d灌注取脑。使用4%多聚甲醛灌注取脑后，切取以视交叉前缘至垂体后缘包含海马区厚约4mm的组织块，用石蜡包埋固定；按5μm厚度连续切片，隔五取三，分别进行HE染色、巢蛋白（Nestin）染色；使用图像分析系统采集图像，随机选取每只大鼠3张非连续切片，随机选取每个部位3～4个非重叠视野进行计数，得出每张切片Nestin阳性细胞数。1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。计量资料用表示，两组间比较采用两独立样本t检验。

2 结果

2.1 大鼠体重变化及脑大体观察 3组大鼠饲养28d后，正常组体重为（363.9±8.4）g，大于酒精组的（333.8± 41.5）g，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组（364.8± 26.4）g比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。酒精组、对照组灌注取脑，MCAO侧半球明显肿胀，以视交叉前缘向前5mm、向后8mm为肉眼所见脑缺血区的大体定位，且酒精组更为严重。大鼠脑底、脑凸面均未发现出血情况。

2.2 脑组织HE染色结果 正常组神经元形态正常，未见神经元损伤。对照组造模后1d可见缺血区域（基底核外侧区、顶叶、颞叶）神经元部分皱缩呈三角形，部分呈不规则形态，细胞核浓染，胞质嗜酸性，中间夹杂一定数量的正常神经元，细胞周围间隙增宽，毛细血管扩张充血；造模后3d缺血区域神经细胞大量脱失，脑组织结构变疏松，呈透亮的筛孔状结构，残存的神经细胞发生固缩，核仁不可见，神经胶质细胞数量明显减少，间质呈空泡样改变甚至大片破坏；造模后7d缺血区域神经细胞大量脱失，残存的神经细胞发生固缩，核仁个别可见，神经胶质细胞反应性增生，神经细胞、神经胶质细胞周围的细胞间隙明显增大，间质染色变淡，组织稀疏。酒精组造模后1、3、7d细胞组织学表现与对照组类似，但神经组织损伤相对更重。3组大鼠造模后HE染色结果，见图1（插页）。

2.3 Nestin染色结果 正常组海马齿状回颗粒下区（subgranular zone，SGZ）可见少数散在分布的Nestin阳性细胞，左右两侧Nestin阳性细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组造模后1d可见SGZ Nestin阳性细胞开始增多，造模后7d达到高峰，缺血侧明显多于对侧（P＜0.05）。酒精组造模后1d可见SGZ Nestin阳性细胞开始增多，造模后3d达到高峰，造模后7d明显回落。酒精组造模后1、3、7d双侧大脑Nestin+细胞数均明显少于对照组（P＜0.05）。3组大鼠造模后Nestin染色结果见图2（插页），SGZ Nestin阳性细胞数见表1。

表1 3组大鼠造模后SGZ区Nestin阳性细胞数（个/视野）

3 讨论

Nestin属于第Ⅵ类中间丝蛋白，是哺乳动物神经系统先祖细胞中的一种主要细胞骨架蛋白。研究发现在神经胚开始形成、NSCs增殖时，会出现Nestin表达；随着神经细胞的迁移，NSCs逐渐向祖细胞分化，Nestin表达逐渐减弱，直至神经细胞迁移完成；出现明显分化特征时，Nestin表达完全停止，并被其他中间纤维蛋白取代[6]。很多研究者把Nestin阳性细胞近似看作是NSCs。

本研究结果显示，对照组大鼠造模后1d可见SGZ Nestin阳性细胞持续增多，与王细林等[7]应用Nestin染色研究脑缺血后NSCs激活的实验结果“SGZ Nestin阳性细胞在脑缺血后7d达到高峰”相同；以上说明MCAO可以诱导NSCs的激活。Shen等[8]亦研究发现大鼠MCAO后3、7d，大脑多个部位存在Nestin阳性细胞。此外，酒精组大鼠造模后亦出现Nestin阳性细胞增多，在造模3d达到高峰后开始回落；与Zhao等[9]研究结果“大剂量慢性酒精暴露（6.4%乙醇水溶液喂养）会加重大鼠脑缺血再灌注损伤”一致；以上提示慢性酒精暴露可以明显抑制NSCs的激活。对照组、酒精组在MCAO后均出现双侧SGZ Nestin阳性细胞增多，且以缺血侧为主；与Jin等[10]研究结果“一侧脑缺血能启动双侧大脑半球的NSCs，且以病灶侧更为明显”一致。

综上所述，一侧MCAO可以诱导SD大鼠双侧NSCs的激活，以缺血侧为主；而大剂量慢性酒精暴露会明显抑制MCAO后早期内源性NSCs的激活与增殖，抑制损伤后神经组织自身的修复，从而导致缺血性脑卒中的预后不良。

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[6]Lendahl U,Zimmerman L B,McKay R D.CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein[J].Cell,1990,60(4): 585-595.

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Effect of chronic alcoholic exposure on endogenous neural stem cells in rat hippocampal dentate gyrus at early stage of acute cerebralischemia and reperfusion

CHEN Zhongliang,LI Zhengyi,LI Honglei.Department of Neurosurgery，Huzhou Central Hospital，Huzhou 313000,China

Objective To investigate the effect of chronic alcoholic exposure on the proliferation of endogenous neural stem cells(NSCs)in rat subgranular zone(SGZ)in hippocampal gyrus at the early stage of acute cerebral ischemia and reperfusion. Methods Forty-two SD rats were divided into 3 groups randomly:6 rats were fed with clean water(normal group), 18 rats underwent middle cerebral artery occlusion(MCAO)/reperfusion and fed with clean water(model group)and 18 rats underwent MCAO/reperfusion and fed with 6%alcoholas(alcohol group).Rats from normal group were sacrificed 28 days after feeding,and rats from model group and alcoholic group were sacrificed at 1,3 or 7 days after establishment of MCAO and reperfusion model,respectively.Brain samples were collected immediately after sacrifice.Brain tissues including hippocampal dentate gyrus were selected for paraffin imbedding and tissue slicing.HE stain was performed to detect the neuron damage,and immunohistochemistry stain was applied to detect the expression of Nestin in brain tissue.Images were obtained by image analysis system and the number of Nestin positive cells in each slice was calculated. Results Based on the HE stain,neuron damage was observed from day 1 after model establishment in model group and alcoholic group,peaked at the day 3 and reduced at the day 7.Neuron damage was not observed in normal group.A few Nestin positive cells were detected in the SGZ of normal group from the immunohistochemistry.In model group,the number of Nestin positive cells increased from day 1 after model establishment,peaked at day 7.And in alcoholic group,the number of Nestin positive cells increased from day 1 after model establishment,peaked at day 3,and reduced at day 7.Compared with model group,the number of Nestin positive cells in SGZ of alcoholic group was significantly reduced(P＜0.05). Conclusion Chronic alcoholic exposure can reduce the proliferation of endogenous NSCs in SGZ,leading to a poor prognosis of cerebral ischemic/reperfusion injuty.

Chronic alcoholic exposure Middle cerebralartery occlusion Neuralstem cells

2016-02-15）

（本文编辑：陈丹）

313000 湖州市中心医院神经外科（陈钟樑）；西安交通大学附属第一医院神经内科（李正仪）；浙江大学医学院附属第二医院神经内科（李红蕾）

李红蕾，E-mail：honglei2015@foxmail.com