miRNA-186靶向Twist-1促胃癌侵袭、迁移的机制研究

徐继 何徐军 叶再元 喻晓芬

●论 著

miRNA-186靶向Twist-1促胃癌侵袭、迁移的机制研究

徐继 何徐军 叶再元 喻晓芬

目的 检测miRNA-186在胃癌中的表达情况，观察miRNA-186表达改变对人胃癌细胞株侵袭、迁移能力的影响并分析可能的分子机制。方法 RT-PCR法检测40例胃癌患者胃癌及配对的正常胃黏膜组织中miRNA-186的表达水平，同时检测miRNA-186在胃癌细胞株和正常胃黏膜上皮细胞中的表达水平。在胃癌细胞中分别转染miRNA-186模拟物（mimic）、抑制物（inhibitor）以上调、下调miRNA-186的表达，应用Transwell试验观察其对胃癌细胞侵袭、迁移能力的影响。应用生物信息学软件预测miRNA-186可能的靶基因，并经双荧光素酶试验及Western blot试验验证靶基因，分析其促转移的分子机制。结果 胃癌组织相较于正常胃黏膜组织、胃癌细胞株相较于正常胃黏膜上皮细胞株的miRNA-186表达水平均降低（均P＜0.05）。在胃癌细胞中，分别上调、下调miRNA-186的表达水平，能够抑制、促进胃癌细胞的侵袭、迁移能力。miRNA-186与Twist-1之间存在反向调控的关系，Twist-1是miRNA-186的靶基因。同时发现，下调miRNA-186的表达时，Twist-1和N-cadherin表达上调，E-cadherin表达下调，而当上调miRNA-186的表达时，Twist-1和N-cadherin表达下调，E-cadherin表达上调。结论 在胃癌组织中miRNA-186的表达水平降低，可能通过靶向调控Twist-1的表达，改变E-cadherin和N-cadherin的表达水平，导致胃癌细胞上皮间质转化，进而促进胃癌细胞的侵袭、迁移。

胃癌 miRNA-186 Twist-1 侵袭 迁移

胃癌是发病率居全球第4位、病死率居我国第2位的恶性肿瘤[1]。由于胃癌患者就诊时多已处于疾病晚期（Ⅲ或Ⅳ期），淋巴结转移率高达50%～75%，同时常有远处转移，术后5年生存率不足40%[2-3]。因此，深入研究有关胃癌发生、发展的分子机制有重要的临床意义。微小RNA（miRNA）是一段长度在22nt左右的非编码RNA核苷酸序列，其通过结合靶基因的3’UTR区影响mRNA转录，抑制蛋白质翻译而发挥作用[4]。研究表明，多种miRNA的异常表达与胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移密切相关，如miRNA-223、miRNA-21、miRNA-27a、miRNA-141等[5-9]。miRNA-186是新近发现的与肿瘤发生相关的miRNA，如膀胱癌、肠癌、非小细胞型肺癌和胰腺癌等[10-13]，其与胃癌的相关研究报道少见。本研究采用RT-PCR法分析miRNA-186在胃癌中的表达情况；在胃癌细胞中上调和下调miRNA-186表达，利用Transwell试验分析其对细胞侵袭、迁移能力的影响；应用生物信息学软件预测相关靶基因,双荧光素酶试验和Western blot试验进一步分析miRNA-186影响胃癌侵袭、转移的可能分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃癌细胞株BGC-823、MKN-45、MKN-28、7901、BGC-803、AGS和正常胃黏膜上皮细胞株GES-1均购自上海中国科学院细胞库；1640培养基购自美国Hyclon公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；细胞侵袭试剂盒（ECM554）和细胞迁移试剂盒（3422）购自美国Millipore公司；PCR引物由华大基因公司合成；Lipofectamine 3000试剂盒购自美国Invitrogen公司，Trizol试剂盒、Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit、Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBRRKit购自日本TaKaRa公司；miRNA-186 inhibitor and mimic购自美国Qiagen公司；Twist-1 3’-UTR报告载体pYr-MirTarget-Twist-1-3U及荧光素酶报告系统购自长沙赢润生物技术有限公司；Twist-1、GAPDH、E-cadherin、N-cadherin抗体购自美国Abcam公司；PVDF膜、超敏化学发光（ECL）试剂盒等常规试剂均购自于杭州捷程生物技术有限公司。

40例胃癌组织及配对的正常胃黏膜组织标本取自2010年1月至10月在浙江省人民医院行手术切除治疗的胃癌患者（年龄38～73岁），冷藏于－80°C冰箱，保存于浙江省胃肠病学重点实验室生物样本库。患者胃癌TNM分期Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期12例，Ⅳ期12例。本研究得到浙江省人民医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胃癌细胞株BGC-823、MKN-45、MKN-28、7901、BGC-803、AGS和正常胃黏膜上皮细胞株GES-1常规培养于含10%胎牛血清的1640培养基（含青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml），置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 mRNA提取、cDNA合成、RT-PCR检测miRNA-186表达水平 按照Trziol试剂盒使用说明书提取组织标本和各细胞株的mRNA；采用Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit进行miRNA cDNA的合成；采用Mir-XTMmiRNA RT-PCR SYBRRKit检测miRNA-186的表达水平。miRNA-186及RNU6b引物分别为5’-GCCCAAAGGTGAATTTTTTG-3’、5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；以95℃5 min、95℃10 s、60℃20 s、72℃20 s共40个循环进行RT-PCR检测反应，并分析其熔化曲线。组织标本及各细胞株的miRNA-186相对表达水平采用2－ΔΔCt法进行计算。

1.2.3 细胞转染miRNA-186抑制物（inhibitor）和模拟物（mimic） 分别以每孔5×105个细胞的密度将胃癌MKN-28细胞（低表达miRNA-186）和7901细胞（高表达miRNA-186）铺于6孔板中；常规培养24h后待其贴壁，利用Lipofectamine 3000试剂盒将MKN-28细胞和7901细胞分别转染miRNA-186 inhibitor和 mimic及相应的阴性对照，所有转染步骤均按照试剂盒说明书执行，转染24h后收集细胞用于后续研究。

1.2.4 Transwell试验检测细胞侵袭、迁移能力 分别利用预先铺有或者没有ECMatrix基质胶的膜孔径为8μm的侵袭、迁移试剂盒分别进行细胞侵袭、迁移试验。分别将上述转染了miRNA-186 inhibitor、mimic及相应阴性对照的胃癌7901及MKN-28细胞用无血清1640培养基调整至适当细胞浓度，分别铺于侵袭、迁移试剂盒的上室（均为每孔10×104个细胞），下室分别加入含30%胎牛血清的1640培养基；培养24h和48h后取出小室，95%乙醇固定10min，用棉签小心拭除上室未穿过微孔膜的细胞，常规HE染色，显微镜下观察各组穿过微孔膜的胃癌细胞，分析上调和下调miRNA-186表达对胃癌细胞侵袭、迁移能力的影响。

1.2.5 miRNA-186靶基因预测及双荧光素酶试验 利用生物信息学软件（miRBase Targets、TargetScan Release 5.0、PicTar databases）预测Twist-1是miRNA-186的一个靶基因。分别将Twist-1 3’-UTR区miRNA-186的结合位点序列（WT序列，野生型序列）及突变型序列（MUT序列，去除了miRNA-186结合位点的Twist-1 3’-UTR序列）插入到pYr-MirTarget-Twist-1-3U的报告载体中。双荧光素酶检测详细操作步骤参见Promega公司的官方Protocol，简要如下：将人293细胞按每孔2×103个细胞分别铺于96孔板中，分为NC组（共转染pYr-MirTarget报告质粒、miRNA-186 mimics）、WT组（共转染pYr-MirTarget-Twist-1-3U报告质粒、miRNA-186 mimics）、MUT组（共转染pYr-MirTarget-Twist-1-MUT-3U报告质粒、miRNA-186 mimics）；每组设3个复孔，48h后利用多功能酶标仪进行双荧光素酶检测，按照说明书配制PLB细胞裂解液、LARⅡ检测液、Stop&Glo检测液；在96孔中加入20μl细胞裂解液，然后加入100μl的LARⅡ溶液，混合后放入发光检测仪检测第1次发光值（海肾荧光值）；接着加入Stop&Glo检测液，终止第1次发光，同时开始第2次发光，混合后放入发光检测仪检测第2次发光值（萤火虫荧光值）；将第2次发光值除以第1次发光值，得到海肾/萤火虫的双荧光素酶检测值。

1.2.5 Western blot法检测蛋白表达水平 分别收集上述转染了miRNA-186 inhibitor、mimic及相应对照的胃癌7901及MKN-28细胞，利用RIPA裂解液在冰上裂解细胞60min，4℃15 000r/min离心30min，小心吸取上清液，用BCA法测定蛋白浓度。取30μg蛋白，10% SDS-PAGE胶电泳，将蛋白转印至0.45μm的PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2h，分别加Twist-1（1∶1 000稀释）、GAPDH（1∶3 000稀释）、E-cadherin（1∶2 000稀释）和N-cadherin（1∶1 000稀释）一抗4℃振荡孵育过夜，TBST洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育1h，TBST洗涤3次，膜上加入ECL试剂，利用化学发光凝胶成像系统（ChemiDoc MP，Bio-rad）检测Western blot条带信号。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件；计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验或配对t检验。

2 结果

2.1 miRNA-186在胃癌组织及胃癌细胞株中的表达水平 见图1。

图1 miRNA-186在胃癌组织及胃癌细胞株中的表达水平（a：在胃癌组织与正常胃黏膜组织中的表达水平比较；b：在不同胃癌细胞株与正常胃黏膜上皮细胞株GES-1中的表达水平比较）

由图1可见，miRNA-186在胃癌组织中的表达水平明显低于在正常胃黏膜组织中的表达水平 [（0.0013± 0.0002）vs（0.0066±0.0008），P＜0.05]；miRNA-186在胃癌细胞株BGC-803、MKN-45、7901、MKN-28、BGC-823、AGS中的表达水平均低于在正常胃黏膜上皮细胞株GES-1中的表达水平（均P＜0.05），且不同胃癌细胞株间两两比较，miRNA-186在胃癌细胞株7901中相对高表达（均P＜0.05），而在胃癌细胞株MKN-28中相对低表达（均P＜0.05）。

2.2 miRNA-186对胃癌7901、MKN-28细胞侵袭、迁移能力的影响 见图2。

由图2可见，与阴性对照相比，胃癌7901细胞转染miRNA-186 inhibitor后侵袭、迁移能力均显著增强，即每视野穿膜细胞数均显著增加（均P＜0.05）；胃癌MKN-28细胞转染miRNA-186 mimics后侵袭、迁移能力均显著减弱，即每视野穿膜细胞数均显著减少（均P＜0.05）。

2.3 miRNA-186靶基因预测与验证 见图3。

由图3可见，生物信息学软件预测到在Twist-1的3’-UTR区有1个miRNA-186的结合位点。Western blot结果显示胃癌细胞中上调miRNA-186的表达能够显著抑制Twist-1的表达（P＜0.05），当抑制miRNA-186的表达时可上调的Twist-1（P＜0.05）。双荧光素酶试验结果显示WT组中的荧光素酶活性明显低于NC组（P＜0.05）；而MUT组的荧光素酶活值与NC组比较无统计学差异（P＞0.05）。

同时Western blot结果显示，在胃癌7901细胞中，转染miRNA-186 inhibitor下调miRNA-186表达后，上皮类标志物E-cadherin表达显著下调（P＜0.05），而间质类标志物N-cadherin显著上调（P＜0.05）。与此相反，在胃癌MKN-28细胞中上调miRNA-186的表达，N-cadherin的表达下调（P＜0.05），E-cadherin的表达上调（P＜0.05）。

图2 miRNA-186对胃癌7901、MKN-28细胞侵袭、迁移能力的影响（a：7901细胞；b：MKN-28细胞）

图3 miRNA-186靶基因预测与验证（a：miRNA-186靶基因结合位点及野生型，突变型载体构建示意图；b：双荧光素酶试验结果；c：Western blot结果）

3 讨论

新近研究显示,miRNA-186在多种肿瘤组织中表达降低，如肺癌、前列腺癌、膀胱癌和肠癌等[10-12,14]。在肺癌中，miRNA-186的表达降低，通过影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力促进肺癌的进展和获得差的预后[12]。在膀胱癌细胞中外源性上调其表达后，miRNA-186通过靶向调控PPM1B基因，将阻滞于细胞G1～S期，从而抑制细胞的增殖[10]。虽然，miRNA-186在大多数肿瘤中低表达，呈现出抑癌基因的功能，但Goeppert等[15]和Myatt等[16]的研究结果显示，在肝癌和子宫内膜癌中，miRNA-186分别通过抑制抑癌基因AKAP12和FOXO1的表达促进肿瘤的进展，呈现出癌基因的活性。本研究结果显示，与在正常胃黏膜组织中相比，miRNA-186在胃癌组织中的表达显著降低；下调miRNA-186的表达能够显著增强胃癌细胞的侵袭、迁移能力，而上调其表达能够抑制胃癌细胞的侵袭、迁移能力。这提示miRNA-186在胃癌中呈现抑癌基因的功能。通过生物信息数据库检索发现Twist-1可能为miRNA-186的1个靶基因。

Twist-1是1个包含碱性螺旋-环-螺旋结构域和氨基酸基序的转录因子，与肌肉、软骨、成骨等细胞的分化有关，其主要功能是调节原肠胚形成和中胚叶发育，提示其在胚胎发育和分化过程中发挥极其重要的作用。此外，Twist-1在调节程序性细胞死亡、炎症过程、形态发生及细胞迁移中同样具有重要意义[17-18]。近年来，大量的研究结果显示表明，Twist-1除了在上述过程中的发挥重要作用外，还参与到肿瘤的起始与扩增、肿瘤微环境调控、干细胞样细胞的形成、上皮间质转化等[19]。目前，Twist-1与肿瘤关系的研究主要集中在其潜在的具有调节癌细胞转移能力和炎症调节作用这两个方面。Pham等[20]发现，Twist-1是抑制细胞免疫和体液免疫的关键因子，它能够通过影响转录因子T-bet、Runx3和STAT4的活性从而降低Th1细胞产生IFN-γ。与此同时，该研究还发现Twist-1能够通过抑制IL-6 mRNA的转录，从而抑制STAT3活化及IL-6反应性，进而抑制滤泡辅助性T细胞和辅助性T细胞17的发育,从而造成肿瘤细胞的免疫逃逸。

上皮间质转化是指上皮型癌细胞转化成具有迁移能力的间质型癌细胞的过程，在此过程中，最具有特征性的变化就是肿瘤细胞上皮极性和分化标记物（如E-cadherin）的缺失、间质标记物（如N-cadherin）的获得。肿瘤细胞获得间质表型后，具有从原位迁出的能力，使其与基质细胞相互作用，浸润邻近组织，侵入淋巴系统或血液循环并定植于其他部位，形成转移灶。Twist-1是肿瘤上皮间质转化过程中的关键诱导因子，Yang等[21]发现，Twist-1可以直接与E-cadherin启动子区的E盒片段进行结合，从而抑制其表达。与此同时，钙粘蛋白家族另一成员N-cadherin也被证实是Twist1的直接靶标[22]，虽然 Twist-1对其作用方式与前者类似，但效果却是相反的。本研究发现Twist-1 3’UTR区存在与miRNA-186相结合的结合位点，利用构建野生型和突变型双荧光素酶报告载体和Western blot试验，结果发现miRNA-186能够直接靶向负调控Twist-1的表达。进一步分析发现，在胃癌细胞中，下调miRNA-186的表达，能够促进胃癌细胞的上皮间质转换，即E-cadherin表达下调和N-cadherin表达的上调。

综上所述，miRNA-186在胃癌组织中表达水平降低，进而显著促进胃癌细胞的侵袭、迁移能力。此促进作用可能与miRNA-186靶向负调控Twist-1表达，下调E-cadherin和上调N-cadherin表达，进而促进肿瘤细胞的上皮间质转变有关。本研究可能有助于临床对miRNA-186促胃癌转移的作用机制的了解，研发新的胃癌治疗靶点。

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miRNA-186 promotes invasion and migration of gastric cancer cells by targeting Twist-1

XU Ji,HE Xujun,YE Zaiyuan,et al.Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,China

Objective To investigate the effects of miRNA-186 on invasion and migration of gastric cancer cells and its possible mechanism. Methods The expression of miRNA-186 in gastric cancer tissue and gastric cancer cell line was detected by qPCR method.A mimic or an inhibitor of miRNA-186 was transfected into the gastric cancer MKN-28 and 7901 cells, respectively and the migration and invasion capacity of transfected cells were investigated using Transwell assays.The target genes of miRNA-186 and corresponding molecules were predicted according to miRBase Targets,TargetScan Release 5.0 and PicTar databases,and indentified by dual luciferase reporter assay and Western-blot assay. Results Among 40 gastric cancer tissue samples and 6 gastric cancer cell lines,the miRNA-186 expression levels were significant decreased compared with normal gastric tissue or cell lines.Transwell assay results indicated that inhibitor the expression of miRNA-186 in 7901 cells by transfecting the miRNA-186 inhibitors,the migration and invasion capacity of the cells was significantly increased,but that in MKN-28 cells transfected with miRNA-186 mimics was significantly decreases.Target gene prediction database and dual luciferase reporter assay indentified that Twist-1 was the target gene of miRNA-186.Western blot showed that the Twist-1 expression level was significantly increased,the cancer epithelial-mesenchymal transformation (EMT)markers E-cadherin was decreased,and the N-cadherin was increased when the expression of miRNA-186 was decreased in transfected 7901 cells.The contrast results were observed when the expression of miRNA-186 was increase in transfected MKN-28 cells. Conclusion MiRNA-186 is down-regulated in gastric cancer tissues,it may promote migration and invasion of gastric cancer cells by targeting Twist-1 and inducing EMT.

Gastric cancermiRNA-186 Twist-1 Invasion Migration

2016-07-20）

（本文编辑：李媚）

浙江省公益性技术应用研究计划项目（2015C33153）；浙江省医药卫生科学研究基金项目（2013KYBO17）

325035 温州医科大学（徐继、叶再元，徐继系在职研究生，现在浙江省人民医院胃肠胰外科工作）；浙江省胃肠病重点实验室（何徐军）；浙江省人民医院手术室（喻晓芬）

叶再元，E-mail:xuji120@163.com