骨髓间充质干细胞治疗实验性自身免疫性重症肌无力的作用机制探讨

翁益云 滕银燕 杨德壕 李佳 张旭

骨髓间充质干细胞治疗实验性自身免疫性重症肌无力的作用机制探讨

翁益云 滕银燕 杨德壕 李佳 张旭

目的 探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）治疗实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）的作用机制。方法 将Lewis大鼠随机分为移植组、模型组和正常对照组，每组各10只。移植组、模型组大鼠腹腔注射单克隆抗体35（mAb35）建立EAMG模型，正常对照组大鼠腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。分离培养BMSCs并作鉴定后，调整密度至1.5x106/600μl PBS，移植组尾静脉注射细胞悬液600μl，模型组和正常对照组均予600μl PBS。采用双盲法、免疫荧光检测、ELISA和real-time RT-PCR分别测定3组大鼠Lennon临床评分、腓肠肌乙酰胆碱受体（AChR）数量变化、血清乙酰胆碱受体抗体（AChR-Ab）含量和腓肠肌AChR、基质金属蛋白酶9（MMP-9）mRNA表达。结果 移植组Lennon临床评分、血清AChR-Ab含量、腓肠肌AChR mRNA表达均低于模型组（P＜0.05）。正常对照组大鼠神经肌肉接头处可见明显红色荧光，移植组可见断断续续、较为微弱的荧光，模型组未见红色荧光。模型组大鼠腓肠肌MMP-9 mRNA表达量明显高于移植组（P＜0.05）。结论 BMSCs能缓解EAMG大鼠的临床症状，抑制MMP-9 mRNA表达可能是其作用机制。

实验性自身免疫性重症肌无力 骨髓间充质干细胞 基质金属蛋白酶9

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种由乙酰 胆碱受体抗体（AChR-Ab）介导、细胞免疫依赖及补体参与的自身免疫性疾病。临床上多采用免疫抑制剂治疗MG，其疗效尚可，但不良反应大、易耐药，因此寻找其他能有效抑制患者免疫功能紊乱的方法是MG研究的热点。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类金属依赖的水解酶家族，可通过水解细胞外基质而在组织重塑过程中发挥作用[1-2]，其中MMP-9水平是典型代表，亦可由MMP-2或MMP-3来激活[3]。发生自身免疫性疾病时，人体血清MMP-9水平会升高[4-7]，且与病情密切相关[8]，也包括MG[9]。目前相关文献报道证实在吉兰巴雷综合征、多发性硬化的动物模型上可通过抑制MMP-1、MMP-9来缓解病情[10-11]。骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是来源于中胚层的一种成体干细胞，可以分泌多种免疫相关的细胞因子并参与机体免疫调节，刘江恒等[12]研究表明移植BMSCs可以改善实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）的临床表现，但具体机制目前尚未明确；故本文建立静脉输注BMSCs治疗EAMG模型，检测Lennon临床评分、腓肠肌乙酰胆碱受体（AChR）数量变化、血清AChR-Ab含量和腓肠肌AChR、MMP-9 mRNA表达，以探讨BMSCs的治疗作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料 实验动物：清洁级纯系雌性Lewis大鼠（上海斯莱克实验动物有限公司），6～8周龄，体重（125.2±10.9）g，健康清洁级环境下饲养。主要试剂：TIB-175杂交瘤细胞（美国ATCC公司）；DMEM/F12、胎牛血清（美国GIBCO公司）；Anti-Mouse/Rat CD 90.1（Thy-1.1）FITC、Anti-Rat CD45 APC（OX1）、Anti-Mouse/Rat CD29 PE、Mouse IgG2a K Isotype Control FITC、Mouse IgG1 K Isotype Control APC、Armenian Hamster IgG Isotype Control PE（美国EBioscience公司）；四甲基罗丹明标记的α-银环蛇毒（美国Sigma公司）；兔抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）、兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP），（武汉博士德生物工程有限公司）；real-time RT-PCR系统（美国Formentas公司）；Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）；引物（美国Invitrogen公司合成）；SYBR GREEN（美国Biorad公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分离、培养及鉴定 BMSCs培养采用全骨髓培养法。无菌条件下分离Lewis大鼠股骨、胫骨并暴露骨髓腔，用DMEM/F12培养液（含1%青链霉素）反复冲洗骨髓腔，用冲出的骨髓制成单细胞悬液，离心沉淀用含10%血清、1%青链霉素的DMEM/F12培养液重悬后于37℃、5%CO2饱和湿度下常规培养。24h半换液，48h半换液，72h全换液，以后换液1次/3d，细胞生长至90%，用胰酶消化传代，体外大量扩增备用。采集经体外培养至第3代的BMSCs，高倍显微镜下观察BMSCs的形态。用诱导液（DMEM/F12、5mmol/Lβ-MEM）诱导BMSCs，采用免疫组化法测定神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达，细胞经4%多聚甲醛固定15min，0.3%Triton-X通透，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶后，以山羊血清封闭15min，滴加兔抗大鼠NSE（1∶100）、兔抗大鼠GFAP（1∶100）4℃孵育过夜（阴性对照用PBS代替一抗），加入生物素标记的山羊抗兔IgG孵15～20min，链亲合素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）染色，PBS洗3次，DAB溶液显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜下观察。用Anti-Mouse/Rat CD 90.1（Thy-1.1）FITC、Anti-RatCD45APC（OX1）、Anti-Mouse/Rat CD29 PE抗体标记，使用流式细胞仪检测BMSCs表面标志抗原的表达率。

1.2.2 实验动物分组及模型制备 将Lewis大鼠随机分为正常对照组、模型组和移植组，每组10只。模型组、移植组大鼠给予腹腔注射浓缩的微克隆抗体35（mAb35）上清液，正常对照组给予腹腔注射等量的0.9%氯化钠溶液。模型诱导成功后5h，移植组大鼠尾静脉注射1.5×106BMSCs细胞悬液600μl（注射前1d细胞培养液换成无青链霉素培养液），模型组、正常对照组大鼠分别尾静脉注射600μl PBS。

1.2.3 Lennon临床评分[13]自移植日起，采用双盲法对3组大鼠每8h作体重测量和Lennon临床评分1次，共5次（48h）。0分：无临床症状，正常肌力；1分：抓握后肌力减弱，叫声低，易疲劳；2分：头部下垂，弓背姿势，前爪屈曲，步态蹒跚，后肢不完全瘫痪；3级：后肢瘫痪无法站立，哭叫无声，濒死状态；4分：死亡。症状介于上述分值中间者分别评为0.5、1.5、2.5和3.5分。

1.2.4 血清AChR-Ab含量的测定 实验结束时取3组大鼠心脏血，离心后取血清，采用ELISA试剂盒检测血清AChR-Ab含量。

1.2.5 腓肠肌AChR数量的测定 取3组大鼠腓肠肌，-20℃行5μm冷冻切片，室温干燥30min，丙酮酸4℃固定10min，PBS洗3次×5min，H2O2灭活内源性过氧化物酶15min，PBS洗3×5min，血清封闭20min，四甲基罗丹明标记的α-银环蛇毒10mg/L 37℃孵育1h，PBS 3次×10min，防淬灭剂封片，采用免疫荧光检测腓肠肌AChR数量变化。

1.2.6 腓肠肌AChR和MMP-9 mRNA表达的检测 取100mg腓肠肌，用Trizol一步法提取总RNA，使用紫外分光光度仪定量测定，并使用Applied Biosystems 7500 real time RT-PCR系统进行分析，反应条件和引物见表1。设正常对照组AChR和MMP-9 mRNA表达量为1，计算模型组、移植组AChR和MMP-9 mRNA表达量。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；两组间比较采用独立样本t检验。

表1 转录因子的引物及PCR反应条件

2 结果

2.1 BMSCs的形态学特征 初始分离的骨髓细胞形态呈圆形，大小不一；24h半换液后可见少数贴壁细胞；48h半换液后，贴壁细胞明显增多，主要呈圆形、多角形、短梭形、纺锤形等，见图1a（插页）；3d全量换液后，细胞形态以梭形、多角形为主，细胞增殖加快并构成较多成纤维样细胞集落，其他杂质细胞逐渐减少；8～10d后细胞可达90%融合。传代细胞一般24h内贴壁，增殖迅速，3～4d可融合至90%；3代后细胞形态较为一致，多呈长梭形、生长均匀，细胞间界线不清、排列规则，有一定的方向性，呈流线型，见图1b（插页）。诱导后细胞形态发生变化，胞体收缩成球形或锥形，折光性增强，有较多长突起，类似于神经元细胞，见图1c（插页）；免疫组化染色显示诱导细胞NSE表达阳性，未诱导细胞不表达，见图1d（插页）。

2.2 BMSCs表面标志抗原的表达率 流式细胞仪检测结果显示大鼠BMSCs表面高表达CD90、CD29，表达率分别为99.04%和98.53%，见图2b（插页）；CD45表达率仅为0.01%，见图2d（插页），详见图2。

2.3 大鼠Lennon临床评分 正常对照组无任何临床表现，Lennon临床评分为0分；实验结束时模型组Lennon临床评分为（2.69±0.96）分，高于移植组的（1.08± 0.66）分，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 血清AChR-Ab含量 正常对照组、模型组和移植组AChR-Ab含量分别为（364.8±15.8）、（1 431±102.9）和（430.85±28.8）ng/ml。模型组相较于移植组、正常对照组，血清AChR-Ab含量明显升高（P＜0.05）；移植组血清AChR-Ab含量略高于正常对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 腓肠肌AChR数量变化 正常对照组大鼠神经肌肉接头（NMJ）处可见明显红色荧光，显示与α-银环蛇毒特异结合的AChR，见图3a（插页）；输注mAb35的模型组未见红色荧光，说明输注的抗体结合了大量的AChR，见图3b（插页）；移植组可见断断续续、较为微弱的荧光，说明移植组大鼠NMJ处仍保留部分AChR，见图3c（插页）。

2.6 腓肠肌AChR mRNA表达 模型组大鼠腓肠肌AChR mRNA表达量为1.640±0.242，高于移植组的1.056±0.118，但差异无统计学意义（P＜0.05）。

2.7 腓肠肌MMP-9 mRNA表达 模型组大鼠腓肠肌MMP-9 mRNA表达量为4.220±0.650，明显高于移植组的0.820±0.085，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

MG是由AChR-Ab介导的自身免疫性疾病，免疫异常致NMJ传递功能障碍而引起骨骼肌的病态疲劳。自身免疫性疾病患者需长期接受免疫抑制剂或细胞毒性药物治疗，但该类药物不良反应较大且不能根治疾病，具有一定的局限性。多年来国内外学者一直致力于寻求一种安全有效的治疗方法。BMSCs具有自我更新、多项分化的潜能，可在体外保持多能特性的前提下快速扩增，而输注体内不会发生同种异体排斥，可以定位于损伤部位并抑制各种炎症、免疫反应，临床上将其作为疾病治疗的种子细胞[14]，目前已应用于移植物抗宿主病、多发性硬化等多种人类疾病的治疗。有研究表明BMSCs能改善EAMG[12]，本文旨拟通过静脉移植BMSCs来探讨其治疗EAMG的作用机制。

目前认为BMSCs无特异性表面抗原，故尚无特异性抗体直接免疫鉴定，大多研究通过细胞形态、流式细胞仪的检测和诱导分化来佐证[15]。整合素家族CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105是BMSCs的重要标志物[16]，且BMSCs不表达造血细胞表面抗原，如CD45、CD34等。因此，本实验选取BMSCs表达阳性的指标CD29、阴性指标CD45和表示未分化状态的CD90作为鉴定指标，结果表明所提取的BMSCs细胞形态一致，多呈长梭形；流式细胞检测结果显示培养的细胞高表达CD90、CD29，低表达CD45，且在β-巯基乙醇诱导下可分化为神经元样细胞；以上结果表明本研究提取的是纯度较高的的BMSCs。将培养成功的BMSCs静脉输注EAMG大鼠后，移植组大鼠Lennon临床评分、血清AChR-Ab含量均明显低于模型组；免疫荧光检测结果可见AChR数量较模型组增多。real time RT-PCR结果显示模型组AChR mRNA表达升高，移植组下降，与Sheng等[17]EAMG模型组大鼠骨骼肌中AChR mRNA表达量增加、病情严重大鼠的表达更高的结果一致，提示静脉输注BMSCs可降低AChR-Ab含量，一定程度上起到保护AChR的作用，从而改善EAMG临床表现。Helgeland等[9]发现MG患者血清MMP-9水平明显上升，上调的MMP-9可能参与炎症细胞的浸润、基膜破坏和自身免疫致病机制。本文通过检测腓肠肌MMP-9 mRNA表达情况，发现模型组MMP-9 mRNA表达明显高于正常对照组，与前期研究结果一致[18]；而移植组MMP-9 mRNA表达有所下降，说明输注BMSCs后可以减少EAMG大鼠促炎蛋白MMP-9 mRNA的表达，与Lee等[19]在人骨髓间充质干细胞（hMSCs）移植治疗心肌梗死小鼠的研究结果一致，原因可能与BMSCs对MMP-9的抑制作用有关。

综上所述，尾静脉注射BMSCs可以有效改善EAMG大鼠的临床症状，下调血清AChR-Ab含量是一种可行的干预方法，作用机制可能与抑制MMP-9表达、减轻EAMG大鼠体内炎症反应有关。

[1]Luckman S P,Gilhus N E,Romi F.Matrix metalloproteinase-3 in myasthenia gravis compared to other neurological disorders and healthy controls[J].Autoimmune Dis,2011,8(5):151258-151261.

[2]黄蕾,李作孝.基质金属蛋白酶在重症肌无力发病中作用的研究进展[J].中华神经医学杂志,2014,13(3):323-324.

[3]ChakrabortiS,MandalM,Das S,et al.Regulation of matrix metalloproteinases:an overview[J].Mol Cell Biochem,2003,253(1-2): 269-285.

[4]Matache C,Stefanescu M,Dragomir C,et al.Matrix metalloproteinase-9 and its natural inhibitor TIMP-1 expressed or secreted by peripheralblood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus[J].J Autoimmun,2003,20(4):323-331.

[5]Kim W U,Min S Y,Cho M L,et al.Elevated matrix metalloproteinase-9 in patients with systemic sclerosis[J].Arthritis Res Ther, 2005,7(1):R71-R79.

[6]Gruber B L,Sorbi D,French D L,et al.Markedly elevated serum MMP-9 (gelatinase B)levels in rheumatoid arthritis:a potentially usefullaboratory marker[J].Clin ImmunolImmunopathol,1996,78 (2):161-171.

[7]Konttinen YT,Halinen S,Hanemaaijer R,et al.Matrix metalloproteinase(MMP)-9 type IVcollagenase/gelatinase implicated in the pathogenesis of Sjogren's syndrome[J].Matrix Biol,1998,17(5): 335-347.

[8]Yong VW,Zabad R K,AgrawalS,et al.Elevation of matrix metalloproteinases (MMPs)in multiple sclerosis and impact of immunomodulators[J].J NeurolSci,2007,259(1-2):79-84.

[9]Helgeland G,Petzold A,Luckman S P,et al.Matrix metalloproteinases in myasthenia gravis[J].Eur Neurol,2011,65(1):53-58.

[10]Zhao X L,Li G Z,Sun B,et al.MMP-mediated cleavage of beta-dystroglycan in myelin sheath is involved in autoimmune neuritis[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,392(4):551-556.

[11]Brundula V,Rewcastle N B,Metz L M,et al.Targeting leukocyte MMPs and transmigration:minocycline as a potentialtherapy for multiple sclerosis[J].Brain,2002,125(Pt 6):1297-1308.

[12]刘江恒,韩志娟,周明言,等.转化生长因子-β在骨髓间充质干细胞治疗实验性自身免疫性重症肌无力机制中的作用[J].中国生物制品学杂志,2010,23(3):225-229.

[13]Baggi F,Annoni A,Ubiali F,et al.Breakdown of tolerance to a self-peptide of acetylcholine receptor alpha-subunit induces experimentalmyasthenia gravis in rats[J].J Immunol,2004,172 (4):2697-703.

[14]Prockop D J,Kota D J,Bazhanov N,et al.Evolving paradigms for repair of tissues by adult stem/progenitor cells(MSCs)[J].J Cell MolMed,2010,14(9):2190-2199.

[15]Oyekunle A,KoehlU,Schieder H,et al.CD34-selected stem cell boost for delay or insuffieient after allogeneic stem cell transplantation[J].Cytotherapy,2006,8(4):375-380.

[16]De Ugarte D A,Alfonso Z,Zuk P A,et al.Differential expression of stem cellmobilization associated molecules on multi2lineage cells from adipose tissue and bone marrow[J].Immunol Lett, 2003,89(2-3):267-270.

[17]Sheng J R,Li L C,Prabhakar B S,et al.Acetylcholine receptos-α subunit expression in myasthenia gravis:a role for the autoantigen in pathogenesis?[J].Muscle Nerve,2009,40(2): 279-286.

[18]滕银燕,李佳,张旭.重症肌无力被动转移大鼠模型的建立及基质金属蛋白酶9表达的改变[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2012, 19(6):429-432.

[19]Lee R H,Pulin A A,Seo M J,et al.Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6 [J].CellStem Cell,2009,5(1):54-63.

Treatment of experimental autoimmune myasthenia gravis with bone marrow stromal stem cells in rats

WENG Yiyun,TENG Yinyan,YANG Dehao,et al.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the effects of bone marrow stromal stem cells(BMSCs)in treatment of experimental autoimmune myasthenia gravis(EAMG)in rats. Methods Thirty Lewis rats were divided randomly into the transplantation group, the model control group and the normal control group with 10 rats in each group.EAMG model was induced by intraperitoneal injection of mAb-35 in transplantation group and model control group.BMSCs were isolated,cultured and identified from healthy Lewis rats.Rats in transplantation group were injected with 1.5×106BMSCs diluted in 600ml PBS,and the same volume of PBS was injected in the model control and the normal control group.The symptoms of rats were observed,the titers of plasma AChR-Ab were detected by ELISA,the AChR changes in gastrocnemius were examined by immunofluorescence technique,and the expressions of AChR and MMP-9 mRNA were detected by real-time RT-PCR in all groups. Results The clinical score,the titers of AChR-Ab,and the expression of AChR mRNA in the transplantation group were significantly lower than those in the model control group.There were no significant differences in above variates between transplantation and the normal control group.The immunofluorescence assay showed EAMG group had no red fluorescence,while the transplantation group had intermittently weak fluorescence.The expression of MMP-9 mRNA was higher in the model control group.However,there was no significant difference between transplantation group and normal control group. Conclusion BMSCs can ameliorate clinical manifestations in EAMG rats,which may be associated with inhibition of MMP-9 expression.

Experimental autoimmune myasthenia gravis Bone marrow stromal cells Matrix metalloproteinase 9

2015-12-17）

（本文编辑：陈丹）

浙江省自然科学基金项目（LY13H090010）

325000 温州医科大学附属第一医院神经内科（翁益云、杨德壕、李佳、张旭），超声影像科（滕银燕）

张旭，E-mail：drzhangxu@live.cn