绣球花品种遗传多样性的ISSR分析及指纹图谱构建

彭继庆，曹福祥，曹基武，董旭杰，刘志明，任 锐，熊亚丽，张鹏鸿

（中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004）

绣球花品种遗传多样性的ISSR分析及指纹图谱构建

彭继庆，曹福祥，曹基武，董旭杰，刘志明，任 锐，熊亚丽，张鹏鸿

（中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004）

利用ISSR-PCR分子标记技术对23个绣球花品种进行遗传多样性研究，从100条引物中筛选出10条引物对供试材料基因组总DNA进行PCR扩增，共扩增出条带123条，其中多态性条带102条，占82.93%，具有较高的多态性。经PopGen32软件包分析，23个绣球花品种的平均有效等位基因数为1.493 7，平均Nei’s基因多样性指数为0.290 7，平均Shannon信息指数为0.435 7，遗传距离介于0～0.769 1之间，遗传一致度介于0.463 4～1.000 0之间，具有广泛的遗传多样性，梦幻蓝和史欧尼10条引物的扩增结果一致，二者可能为同一个品种。UPGMA聚类将23个品种分成2类，聚类结果与叶片特征一致。引物UBC855可以将23个绣球花品种完全区分，依此建立了23个绣球花品种的指纹图谱。研究结果为绣球花分类，品种鉴定、分子育种和子代鉴定提供了重要的依据。

绣球花；ISSR；遗传多样性；指纹图谱

绣球花Hydrangea macrophylla又名八仙花，属绣球花科 Hydrangeaceae绣球花属，常绿或落叶亚灌木、灌木或小乔木，主要分布于亚洲东部至东南部、北美洲东南部至中美洲和南美洲西部，是世界上极具发展潜力的花卉品种之一。我国是绣球花的发源地，全国约37种，7变种，是绣球花属植物资源最为丰富的国家之一，然而我国对绣球花研究多集中在繁育[1-3]病虫害治理[4]和次生代谢[5-6]等方面，新品种培育方研究甚少，仅有屈连伟[7]和海风[8]等2篇报道。市场上的绣球花品种主要来至于欧美国家，我国绣球花品种基本处于野生、半野生状态，建立我国绣球花新品种培育体系，培育我国自主品种的绣球花品种已经迫在眉睫。

ISSR分子标记技术具有成本低、稳定性高、操作简单、重复性高等特点[9]，在杂交育种、亲缘关系鉴定、指纹图谱构建等方面已被广泛应用，在花卉方面应用范围越来越广泛。董海燕等[10]对红花檵木品种间遗传多样性和亲缘关系分析表明，41个红花檵木品种聚为5类，聚类结果支持叶色作为最高分类等级。胡仲义等对重庆南山植物园中的26株川茶花[11]古树进行遗传多样性研究表明， 26个品种分为5个类群，牡丹茶与山牡丹之间遗传相似性最大，可能为牡丹茶的芽变品种。孙利娜等利用ISSR分子标记技术对百合[12]辐射突变体进行分子鉴定表明经60 Co～γ射线辐射获得的变异百合在DNA水平上存在多态性差异。严华[13]对国兰遗传多样性进行了研究，并建立了部分国兰的指纹图谱。黄颖桢等[14]对不同种源的野生金线莲间遗传多样性进行研究，王湘莹等[15]成功分析了23个金银花品种间的遗传变异，杨梅等[16]将9个武当木兰典型种群分为3大类群，聚类结果与地理分布和花部特征划分大致一致。高武军对20个红花[17]品种进行了遗传多样性研究，20个品种聚为5类。此外，崇明水仙[18]，金叶女贞[19]，芍药[20]等品种或杂交后代也进行了ISSR分子鉴定。

本研究对22个国外绣球花品种和1个绣球（来自国内）进行ISSR遗传多样性研究，对其遗传多样性做出全面、客观的评价，了解育种亲本之间的分子基础，有利于杂交后代的早期检测，为绣球花新品种培育提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本实验所用植物材料为绣球花品种，来自于中南林业科技大学，共23个品种，其中8个品种引种于美国乔治亚大学，14个品种引种于荷兰或意大利，1种绣球（表1），选取植株上叶片完整，生长状况好，表面没有病虫害和微生物污染的新鲜叶片作为实验材料

表1 23个绣球花品种名称和来源Table 1 The name and source of 23 varieties of Hydrangea macrophylla

1.2 ISSR引物

本实验所用的引物序列来源于加拿大哥伦比亚大学公布的第九套ISSR引物序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，筛选引物编号及序列（表2）。

1.3 实验方法

绣球花基因组总DNA利用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生物科技（北京）有限责任公司）进行提取，经琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白分析仪检测合格后，稀释至50 ng/μL，备用。绣球花品种ISSR-PCR扩增反应体系在参考博白大果油茶[22]、壳菜果[23]、野生小果油茶[24]、钩栗[25]、仙茅[26]等植物反应体系的基础上进行优化并确立，最佳应体 系 为（20 μL）：10×PCR Buffer 2.0 μL，DNA 30 ng， Mg2+2.0 mmol/L，ISSR 引物 0.6 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1.5 U，最后用ddH2O将体系补足到20 μL。扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火45 s，72 ℃延伸90 s，共36个循环，72 ℃总延伸420 s，PCR扩增产物在4 ℃保存。琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统成像并拍照。

以200 bp ladder DNA marker作为参考，根据电泳图谱，确定所有样品图谱中扩增条带的位置和大小，统计扩增条带，清晰、可辨认的条带记为“1”，模糊不清或没有条带的，记为“0”，并按照片段大小进行排序，形成原始矩阵，根据Hardy-Weinberg平衡对原始矩阵进行修正。利用PopGen32软件包对修正后的数据矩阵进行计算、分析，利用MEGA6对绣球花品种进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 绣球花引进品种ISSR分子标记的多态性

10条引物对绣球花23个品种进行ISSR-PCR扩增（见图1），10条引物共扩增了123条条带，条带大小在180 bp～3 000 bp之间，条带清晰，分布比较均匀，其中多态性条带共102条，多态性条带百分比为82.93%，表现出丰富的多态性。每条引物均能扩张出11～14条清晰的条带（表2），扩增条带最多的引物是UBC815和UBC899，各扩增出14条条带；多态性条带在7～13条之间，多态性条带百分比最高的是UBC899，共扩增13条多态性条带，多态性条带百分比为92.86%，多态性条带百分比最低的是UBC841和UBC876，为63.64%，10条引物均能扩增出多态性条带，可以利用10条引物进行绣球花品种鉴定。通过PopGen32软件包对绣球花品种分析，23个绣球花品种的平均观测位点数na为1.829 3，有效等位位点数ne为1.493 7，Nei’s基因多样性 h 为 0.290 7，Shonnon’s 信息指数为0.242 4，标准差分别为0.377 8、0.346 3、0.176 1和0.242 4，绣球花品种具有丰富的遗传多样性。

图1 UBC895对23个绣球花品种ISSR-PCR扩增结果Fig.1 The result of polymorphism PCR of 23 varieties of Hydrangea macrophylla in primer UBC895

表2 ISSR引物扩增的位点Table 2 Amplification sites of ISSR primers

2.2 绣球花引进品种遗传距离和遗传一致度

对绣球花品种进行遗传距离和遗传一致度分析表明，23个品种的遗传距离介于0～0.769 1，平均值为0.373 5；遗传一致度介于0.463 4～1.000 0之间，平均值为0.696 2，23个品种中遗传一致度最近的是梦幻蓝和史欧尼，为1.000 0，两个品种均是由意大利或荷兰培育而出的新品种，在形态方面具有很高的相似性；遗传一致度最低的是罗斯和幻影绣球，仅为0.463 4，罗斯引种于荷兰或意大利，幻影绣球引种于美国，二者在形态上也存在很大的区别，罗斯叶片肥厚，叶片较大，心形叶，球状花序，而幻影绣球叶片较小，表面比较粗糙，枝条较细，圆锥形花序。绣球花品种间遗传差异大与绣球花品种的培育方式有很大的关系，目前绣球花新品种都采用杂交育种的方式，为了出现很好的性状分离，母本和父本之间在同属之间亲缘关系相对较远，或者采用不同属之间杂交，从而导致了绣球花品种间出现较大的遗传变异。

2.3 绣球花品种聚类和亲缘关系分析

利用Popgen32软件包和MEGA6对23个绣球花品种进行UPGMA聚类分析表明，23个绣球花品种分为2个大类，聚类结果与叶片形态特征一致（见图2）。第1类包括香草草莓、粉宝石绣球、石灰灯和幻影绣球4个品种，其中粉宝石绣球和石灰灯的亲缘关系最近。该类群的具有极大的相似性，花序为圆锥形花序，叶片较小且叶片薄，叶表面粗糙，枝条较细，分枝多等特征。第2类包括19个品种，该类群花序为球形花序或伞形花序，叶片肥大，叶表面光滑，分枝少，枝条粗壮。第2类群在遗传距离阈值为14.5时可以分为4个亚群，第一亚群包括魔幻水晶、变叶绣球、魔幻紫水晶、红宝石绣球、梦幻蓝、史欧尼、精灵、罗斯、塞尔玛和伊米莉亚绣球，梦幻蓝和史欧尼亲缘关机最近，二者遗传距离为0，遗传一致度为100.00%，形态特征上二者基本一致，叶片、花序等形态特征无明显差别，二者可能为同一品种。第二亚群包括无尽夏、彭妮马克绣球、蓝尼康绣球、南丁格尔绣球、绣球、拉维布兰6个品种，我国的绣球和美国的南丁格尔绣球亲缘关系比较相近，遗传距离为0.187 2，遗传一致度为82.93%；第三亚群为新娘和塔贝；粉色回忆单独成为一个亚群。

图2 绣球花品种UPGMA聚类图Fig.2 The UPGMA phylogenetic tree of varieties of Hydrangea macrophylla

2.4 绣球花引进品种鉴定

利用10条ISSR引物对23个绣球花品种进行品种鉴定，经统计分析（表3），10条引物共鉴定出22个绣球花品种，但绣球花品种‘梦幻蓝’和绣球花品种‘史欧尼’的DNA指纹图谱完全一致，10个引物的遗传距离为0，遗传一致度为100%，二者在形态特征上也没有明显的差异，因此将二者定为一个品种。每条引物鉴定绣球花品种的数量在5～21个之间，存在很大的差异，鉴定数量最多的是UBC855，共鉴定出21个绣球花品种，鉴定数量最少的是UBA876，仅鉴定出5个绣球花品种。鉴定出10个绣球花品种以上的引物多大7个，分别是UBC815、UBC824、UBC835、UBC841、UBC855、UBC895、UBC899，表明ISSR引物能很好地进行绣球花品种鉴定。

2.5 绣球花品种DNA指纹图谱构建

10条ISSR引物中，UBC855能够将22品种进行很好地鉴定，因此，利用UBC855对22个绣球花品种进行DNA指纹图谱构建，UBC855对22个绣球花品种均能进行很好的扩增，扩增片段长度在220～1 400 bp之间，条带清晰，多态性条带丰富。片段长度小于220 bp或大于1 400 bp，扩增片段模糊不清，因此不予统计。根据扩增条带的有无，有条带记为“1”，没条带记为“0”，建立22个绣球花品种的计算机化DNA指纹图谱，如表4。

表3 ISSR引物对绣球花品种鉴定Table 3 Identification of varieties of Hydrangea macrophylla based on ISSR primers

表4 绣球花品种的计算机化DNA指纹图谱†Table 4 The computerized DNA fingerprint of varieties of Hydrangea macrophylla

3 结论与讨论

通过对23个绣球花品种进行遗传多样性分析，绣球花多态条带百分比为82.92%，远低于大菊品种的92.5%[21]，高于红花檵木品种的72.9%，遗传多样性较高。遗传距离介于0～0.769 1，平均值为0.373 5；遗传一致度介于0.463 4～1.000 0之间，平均值为0.696 2，遗传距离和遗传一致度跨度较大，和大菊品种的遗传多样性特征相似，应该有两方面原因，一是分布广泛，绣球花资源种类较多，分布更是跨不同气候带，具有很好的遗传基础；二是绣球花新品种培育多采用杂交育种的方式，有利于品种或种之间的基因交流。

ISSR分子标记技术具有检测灵敏、多态性好、稳定、重复性高等优点。利用ISSR分子标记技术对23个绣球花品种鉴定过程中，10条引物均能对绣球花品种进行很好的鉴定，品种间遗传一致度和遗传距离跨度大，与绣球花杂交育种和新品种培育方式相关。而10条引物对‘梦幻蓝’和‘史欧尼’两品种扩增条带图谱完全一致，二者在形态特征，生长表现也无明显差异，两个品种极有可能为同一品种，由此可见，ISSR分子标记技术在绣球花品种鉴定方面具有很好的应用价值。聚类结果与绣球花品种叶片和花序形态特征一致，香草草莓、粉宝石绣球、石灰灯和幻影绣球4个绣球花品种叶片椭圆形，叶片薄且表面粗糙，花序为圆锥形花序；其余品种叶片呈心形，叶片厚而光滑，球形或聚伞花序，因此，UPGMA聚类结果可以作为绣球花品种叶片和花序分类的依据。但也存在不足，该方法聚类结果并不能将球形花序品种和聚伞花序品种完全区分，可能是由于方法本身限制，也有可能是未筛选出合适引物，具体原因还需进一步研究。

指纹图谱在植物品种鉴定、亲子分析、杂种真伪鉴定和知识产权保护等方面具有重要作用。本研究利用ISSR分子标记技术可以将绣球花品种很好地区分，所选10条引物中有7条能区分出15个及以上品种，鉴定品种最多的是引物UBC855，可以鉴定出全部23个品种，利用引物UBC855进行绣球花品种的指纹图谱构建，有利于绣球花品种鉴定和真伪辨别，有利于绣球花新品种培育，子代检测鉴定，同时还可为为绣球花杂交育种提供指导，具有重要意义。

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Genetic diversity and fi ngerprint construction of varieties of Hydrangea macrophylla by ISSR markers

PENG Ji-qing, CAO Fu-xiang, CAO Ji-wu, DONG Xu-jie, LIU Zhi-ming, REN Rui, XIONG Ya-li, ZHANG Peng-hong
(College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

ISSR-PCR was used to detect the genetic diversity and relationship of 23 varieties ofHydrangea macrophylla. ISSR fi ngerprinting ampli fi ed by 10 ISSR primers which were selected from 100 ISSR primers revealed a total number of 123 unambiguous bands, of which 102 ones were polymorphic and the polymorphism frequency was 82.93%. As analyzed by PopGen32, the mean effective number of alleles of 23 varieties ofHydrangea macrophylla, the mean Nei’s genetic diversity index is 0.2907, the mean Shannon information index is 0.435 7, the genetic distance between varieties ranged from 0 to 0.769 1 and the similarity coef fi cient ranged from 0.463 4 to 1, the genetic diversity is higher, the result ofHydrangea macrophylla‘rathen’ andHydrangea macrophylla‘masja’ are consistent, they may be as one variety. These 23 varieties ofHydrangea macrophyllawere divided into two groups by UPGMA based on the similarity coef fi cient, which is consistent with the classi fi cation results according to the blade features. Because 23 varieties ofHydrangea macrophyllacan be completely distinguished by the UBC855 primer, the fi ngerprint of 23 varietiesHydrangea macrophyllawas established. The result can be used as a basis for classification ofHydrangea macrophylla, variety identification,molecular breeding and offspring identify.

Hydrangea macrophylla; ISSR; genetic diversity; fi ngerprint

S718.46

A

1673-923X(2016)12-0115-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.12.020

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-12-31

国家林业局948项目“绣球花植物新品种及繁育技术引进”(2013-4-35)；湖南省科技厅重点研发项目：绣球花新优品种培育及开发利用（2016NK2143）；湖南省教育厅一般项目“绣球花品种遗传多样性的ISSR研究及指纹图谱构建”（15C1433）

彭继庆，讲师，硕士

曹福祥，教授，博士；E-mail：csfucao@163.com

彭继庆，曹福祥，曹基武，等. 绣球花品种遗传多样性的ISSR分析及指纹图谱构建[J].中南林业科技大学学报，2016,36(12): 115-120.

[本文编校：文凤鸣]