不同种源油茶良种花粉生活力研究

王湘南，陈永忠，王 瑞，陈隆升，彭邵锋，马 力，罗 健，唐 炜

（湖南省林业科学院 国家油茶工程技术研究中心，湖南 长沙 410004）

不同种源油茶良种花粉生活力研究

王湘南，陈永忠，王 瑞，陈隆升，彭邵锋，马 力，罗 健，唐 炜

（湖南省林业科学院 国家油茶工程技术研究中心，湖南 长沙 410004）

采用TTC法和琼脂培养基离体萌发法对来自湖南、江西、广西种源的油茶主栽良种进行了花粉生活力和萌发力的测定。结果表明：（1）油茶不同种源良种之间花粉生活力存在较大差异，本实验良种中的花粉生活力较高，花粉活力值范围在87.51%～66.98%之间，花粉萌发力值范围在87.91%～70.47%之间，显示了良种的优良特性；（2）湖南种源油茶良种花粉萌发最适培养基为1%琼脂+10%蔗糖+0.015%硼酸，江西和广西种源的良种通过调整蔗糖和硼酸浓度可使花粉萌发达最佳。采用TTC法和琼脂培养基离体萌发法同时检测花粉生活力可以相互校验；（3）花粉生活力大小与品种内在遗传特性有关，也与立地和气候有一定关系。

油茶；良种；花粉；培养基；花粉生活力；萌发力

油茶Camellia oleifera属灌木或乔木[1-2]，是我国南方重要木本油料树种之一，广泛分布于我国长江流域以南的大部分地区[3-4]，其主要产品油茶籽油营养丰富，油酸、亚油酸含量高达90%，是一种优质、营养、保健的高级植物食用油[4-9]。其副产物茶粕、果壳等经加工也是重要的医药、化工等工业原料[10-14]。油茶生长相对缓慢，生命周期长，秋冬开花来年秋冬果熟，常花果同期，这是油茶植物生殖过程的一大特征。油茶品种花粉生活力关系到油茶授粉受精以及品种配置，直接影响到油茶产量和效益，因此了解和掌握油茶不同品种间的花粉生活力对充分了解其品种特性、提高油茶授粉坐果率从而提高油茶产量具有重要指导作用。

花粉是植物遗传信息的载体和遗传信息交流的工具。花粉生活力是体现其具备萌发和受精能力的指标之一[15]。花粉生活力因植物种类不同而差异很大。在自然条件下，大多数植物的花粉从花药散出后只能存活几小时，几天或几个星期。一般木本植物花粉寿命比草本植物的长[16]。花粉具有萌发活力，这是完成受精的必要条件[17]。有关油茶品种花粉生活力报道不多，李开祥等[18]报道油茶岑软2、3号等8个无性系在开花当天花粉生活力均达50%以上，其中岑软2、3号是来自广西北回归线以南种源地最主要的良种。王湘南[19]所测定的30个不同种源油茶种质的花粉生活力在38.51%～91.85%之间，雄性不育系除外仅为0～0.4%。王玉娟等[20]测定油茶赣无26个无性系花粉活力在45.87%～93.16%之间。全国油茶无性系良种有200余个，分布区域范围广，不同立地与气候对油茶的开花授粉、花粉生活力会产生一定影响。本实验以湖南、江西、广西3省不同种源优良品种为材料，在相同立地条件下同时对它们进行花粉活力及萌发力检测比较，掌握众多油茶良种中尤其是不同种源地的油茶良种其花粉活力的特性，为油茶的良种筛选及品种配置、提高油茶授粉坐果率等生产实际问题提供科学的分析测试数据及指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 取样地概况

试验材料取自湖南省林科院试验林场国家级油茶种质资源收集保存圃。资源圃位于长沙市南郊，地理位置东经 113°01′E，北纬 28°06′N，海拔高度100 m左右。土壤为第四纪酸性红壤，土层厚度60～100 cm，有机质含量1.61%，pH值4.84。气候属中亚热带季风气候，四季分明，夏秋高温常旱，全年无霜期约275 d，年平均气温16.8～17.2 ℃，年降水量1 422 mm。

1.1.2 供试材料

供试种源材料分别来自湖南、江西、广西三省生产上主推应用的良种“湘林”系列、“赣无”系列和“岑软”及“桂无”系列共9个品种，分别是湖南的湘林1、湘林27、湘林97，江西的赣兴46、赣石83-4、赣永6，广西的岑软2、岑软3和桂无2。为了研究其树龄与花粉活力的关系，采样植株分为中幼林与换冠嫁接大树成林。⑴中幼林树：2006年春以1～2年生无性系嫁接苗和实生家系苗造林的植株，2010年底平均树高2.0 m，平均冠幅2.8 m2；⑵成林树：2004年通过大树高接换冠的换冠林植株，树冠完全恢复，2010年底平均树高2.7 m，平均冠幅4.3 m2。2011年以后每年进行适当轻度修剪，其它按照油茶正常抚育管理水平进行管理。

1.2 研究方法

1.2.1 花粉采集与预处理

花粉样品于每年油茶花期的11月下旬至1月上旬连续5次采集，不同年份重复对比。采集时间段为当日上午11:00～12:00。取样时选取带有大花蕾时期的花枝若干，选取花蕾成熟度和大小基本一致，成熟度最好基本能够在同一天开放。花苞样品采集后，立即带回实验室，进行25 ℃生化培养箱恒温水培，水培时，根据自然光线强度补充适宜光照。水培至花蕾开放，花药开裂后，用头发丝小心剥落花粉，不同省源不同品种的花粉隔离处理，以免花粉相互污染。将所得花粉在硫酸纸上充分阴干后，小心收集于细口棕色瓶中，贴上标签备用。

1.2.2 花粉生活力测定

油茶花粉生活力测定采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑法（TTC法）与琼脂培养法。

（1）TTC法是一种快速测定花粉生活力的方法。具有生活力的花粉，在呼吸代谢过程中，花粉细胞内部的脱氢酶在催化脱氢的过程中，把氢转移到TTC上，而TTC与氢结合后，使有生活力的花粉变成红色；而丧失生活力或者败育的花粉没有呼吸代谢作用，TTC不被还原，因而花粉不被着色。

测定时用毛笔小心播撒适量花粉于洁净的载玻片上，在花粉上小心滴加1～2滴0.5%的TTC溶液并涂抹均匀，之后小心盖上盖玻片。25 ℃恒温箱中放置15～30 min，然后在10×10倍显微镜下进行视野中总花粉粒及显红色（粉红色）花粉粒数目观察，每样做3个平行玻片，每玻片选取5个视野进行统计。选取视野时，要选取花粉粒分布均匀且花粉粒数目不少于50粒的视野进行统计。

（2）琼脂培养基离体萌发法。参考何春燕、袁德义等[21-24]采用的油茶花粉离体萌发培养基配方进行试验。用玻璃棒蘸取适量加热完全融化的培养基悬滴在洁净的单凹载玻片上，使之厚薄均匀，接近圆形，培养基内无气泡。之后用毛笔小心播撒适量花粉于培养基表面。置于25 ℃恒温生化培养箱中进行培养，4 h后在10×10倍显微镜下开始镜检计数，24 h后仍未萌发的花粉粒可以定为不会萌发的花粉。计数时，以花粉管长度超过花粉粒直径作为萌发标准。每样做5平行玻片，每玻片取3个视野。选取视野时，要选取花粉粒分布均匀且花粉粒数目不少于50粒的视野进行统计。

花粉萌发率=视野中已萌发的花粉粒数目/该视野中总的花粉粒数目×100%。

2 结果与分析

2.1 两种测定花粉生活力的方法比较

用TTC法对不同种源花粉生活力的测定时发现，经过0.5%的TTC溶液染色后，各品种花粉的颜色均有明显变化，出现红色或粉红色，随着时间的延长，红色会逐渐加深至深红色或暗红色（见图1）。统计结果表明，各主推应用良种的油茶花粉均有较高的生活力，不同种源之间存在一定差异。测定结果见表1。

经过实验筛选，筛选出适合本实验良种最适花粉萌发培养基配方，其中湖南种源油茶良种花粉萌发最适培养基为1%琼脂+10%蔗糖+0.015%硼酸，江西的为1%琼脂+8%蔗糖+0.01%硼酸，广西的为1%琼脂+10%蔗糖+0.012%硼酸。在以上培养基上3省种源的油茶良种的花粉均有较好的萌发（见图2），通过5次平行试验，发现花粉萌发率较为稳定，且RSD值较TTC法测定结果偏小（见表2）。琼脂培养基离体萌发法操作较为简单、快速且结果较为直观，只需要一般的显微镜即可进行花粉萌发率的测定，该法可以有效测定山茶属植物花粉的生活力。

图1 TTC法检测花粉生活力Fig.1 Pollen viability examination by TTC

表1 3省种源油茶品种TTC法花粉生活力测定结果Table 1 The pollen viability determination of Camellia oleifera germplasms of three provinces by TTC method

图2 琼脂培养基花粉离体萌发Fig.2 Pollen germination in vitro

表2 3省种源油茶品种琼脂培养基离体萌发法花粉生活力测定结果Table 2 The pollen viability determination of Camellia oleifera germplasms of three provinces using agar vitro germination

2.2 不同种源油茶花粉生活力比较

通过对本实验中的3省种源油茶良种花粉生活力的连续取样测定，实验结果发现，不同种源油茶良种花粉生活力之间存在较大差异。本实验中湖南种源3个湘林号品种花粉生活力均值较高，其不同品种间存在一定差异（见图3）；江西种源的花粉生活力5次不同花期采样测定的数值相对较稳定，其品种之间的差异相对较小（见图4）；广西种源的花粉生活力值相比湖南和江西种源的花粉生活力值略小，其品种间差异在三者中最大（见图5）。

图3 湖南种源油茶品种花粉生活力测定结果Fig. 3 The pollen viability determination of Camellia oleifera germplasms of Hunan province

图4 江西种源油茶品种花粉生活力测定结果Fig. 4 The pollen viability determination of Camellia oleifera germplasms of Jiangxi province

图5 广西种源油茶品种花粉生活力测定结果Fig. 5 The pollen viability determination of Camellia oleifera germplasms of Guangxi province

3 结论与讨论

（1）通过对湖南、江西和广西3省（区）种源油茶主推良种在相同立地条件下进行花粉生活力和萌发力检测结果得出，它们的花粉活力值在87.51%～66.98%之间，花粉萌发力值在87.91%～70.47%之间，表现出了较高的花粉生活力，但种源间存在显著差异。不同林龄、不同年份检测的结果相近。花粉生活力高低与品种内在遗传特性有关，同时也受其立地及气候的影响。湖南、江西、广西种源的油茶良种花粉生活力既有种质遗传差异，也与是否适地适树有一定相关。如李开祥等[18]在广西实验地对油茶不同无性系花粉活力检测结果显示：广西种源无性系其花粉活力表现要比来自湖南种源湘林无性系花粉生活力高。导致这一结论的原因除了实验中所选择的无性系不同其花粉生活力不同外，另一个重要原因应是湖南种源的无性系引种到广西该地区存在适应性问题。据王湘南[19]对湖南长沙油茶资源圃测定30个油茶种质的花粉生活力在38.51%～91.85%之间，其中湖南油茶良种湘林1号花粉生活力高达90%以上，而所测定的花粉活力低的只有38.51%。可见油茶不同种质、品种间其花粉活力差异非常显著。本实验中的油茶良种花粉生活力明显较高，显示出了良种的优良特性。

（2）湖南种源油茶良种花粉萌发最适培养基为1%琼脂+10%蔗糖+0.015%硼酸，江西和广西种源良种通过调整蔗糖和硼酸浓度可使花粉萌发达最佳状态。不同种源品种花粉琼脂培养基离体萌发需多次实验，调整培养基配方，做到花粉充分萌发而使检测结果真实可靠。

（3）采用TTC法和琼脂培养基离体萌发法同时检测花粉生活力可以起到相互校验而让检测结果更加准确。按常规用TTC染色法检测花粉生活力值应该比用琼脂培养基离体萌发法检测的花粉萌发力值略高，因为存在花粉有活力但不一定能够萌发的现象。但从实验数据结果显示它们之间没有很明显的必然规律，有略高也有略低。分析有可能是实验操作中不可控因素造成。采用这2种方法同时检测起到较好的校验和修正作用。

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Study on pollen viability of Camellia oleifera improved varieties from different species

WANG Xiang-nan, CHEN Yong-zhong, WANG Rui, CHEN Long-sheng, PENG Shao-feng, MA Li, LUO Jian, TANG Wei
(National Engineering Research Center for Oil-tea Camellia, Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China)

Pollen viability and germination ability were studied on ordinaryCamellia oleiferacultivars from Hunan, Jiangxi and Guangxi provinces, by TTC method and agar in vitro germination. The result showed: Firstly, the pollen viability of differentCamellia oleiferacultivars from different regions were differences, pollen viability of improved varieties from Hunan ware higher in this experiment at about 87.51%-66.98%, pollen germination capacity range from 87.91%-70.47%, displayed the excellent characteristics of the improved varieties; Secondly, provenance ofCamellia oleiferafrom Hunan optimal pollen germination medium was 1% agar+10%sucrose+0.015% boric acid, provenance ofCamellia oleiferafrom Jiangxi and Guangxi ware slightly changed the concentration of sucrose and boric acidity before achieving the best pollen germination. TTC method using an agar medium and germinated in vitro method for simultaneous detection of pollen viability can check each other; Thirdly, the level of pollen viability related to inherent genetic characteristics of the species, and is relevant with site and weather conditions.

Camellia oleifera; improved varieties; pollen; medium; pollen viability; pollen germination rate

S794.4

A

1673-923X(2016)12-0001-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.12.001

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-08-14

湖南省科技厅重大专项“油茶高产、高含油、高抗逆良种组合筛选”（2013FJ1006-1）

王湘南，研究员，硕士

陈永忠，博士生导师，博士；E-mail：chenyongzhong06@163.com

王湘南，陈永忠，王 瑞，等. 不同种源油茶良种花粉生活力研究[J].中南林业科技大学学报，2016, 36(12): 1-5.

[本文编校：文凤鸣]