油茶产黄酮内生真菌的初步研究

 张 婷，左雪枝，马 丹 

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北 荆门 448000）

油茶产黄酮内生真菌的初步研究

张 婷，左雪枝，马 丹

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北 荆门 448000）

试验通过对前期从油茶中分离出的内生真菌进行液体发酵培养、浓缩发酵液等操作获得菌株的次生代谢产物，继而通过盐酸-镁粉颜色反应初筛和薄层层析法复筛，得到2株具有产黄酮能力的内生真菌。这2株内生真菌经形态学鉴定分属于青霉属（Penicillium）和链格孢属（Alternaria），并测得发酵液中的黄酮含量分别为0.0113和0.0135mg/mL。

油茶；内生真菌；黄酮；青霉属；链格孢属

油茶（Camellia oleifera），属山茶科山茶属，为我国南方特有的木本油料，与油棕、油橄榄、椰子并称为世界四大木本油料。油茶除了主要产品茶油外，还具有多种生理活性物质如皂素、多酚、黄酮等，它们具有抗氧化、抑菌、抗癌、免疫调节等多种功能，可用于食品、药品、化妆品等领域。目前，这些物质主要从茶枯饼或茶籽壳中提取，由于提取率不高，难以富集，造成原本低廉的茶枯饼或茶籽壳价格一路攀升[1-2]。

自1993年从短叶紫杉中发现能产紫杉醇的内生真菌以来，植物内生真菌就以一种潜在的、有极大应用价值的微生物资源进入研究人员的视野，引起了广泛的关注。植物内生真菌（plant endophytic fungi）是指在健康植物的组织和器官寄生并度过全部或近全部生活周期而不使寄主表现出任何症状的一类真菌[3]。内生真菌物种丰富，数量庞大，几乎每种植物中都可以分离出少则数十种多则上百种的内生真菌，内生真菌对植物中某些活性成分的形成有重要影响，甚至会产生与宿主相同或相似的生理活性成分，而内生真菌又具有生长和繁殖快速、培养简便、成本低廉等优点，从内生真菌中获得生理活性物质不仅可以突破植物资源缺乏、再生周期长等限制，而且利用工业化发酵可以实现天然活性化合物成本低、无污染的大规模生产。

目前鲜有关于油茶内生真菌的报道，仅周生亮等[4]利用rDNA ITS免培养法从油茶叶片获得12种内生真菌的序列，根据系统发育分析全部为子囊菌，其中曲霉属（Aspergillus）为优势属，而有关油茶内生真菌次生代谢产物的研究尚未报道。本研究对油茶根茎叶中分离到的内生真菌进行发酵培养，通过颜色反应和薄层层析法初步筛选出产黄酮内生真菌，并对它们进行了形态学鉴定和产黄酮能力初测，为摸索油茶生理活性物质新的生产途径提供科学依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

采用传统的组织块分离法从健康的油茶样品中分离出内生真菌，纯化后保存于该校微生物实验室。

1.2内生真菌液体发酵培养

将保存的菌种在28℃活化培养，然后挑取两环菌种接入250 mL PDA液体培养基中，每3个菌种接入同一个锥形瓶，28℃、120 r/min恒温摇床培养7 d。

1.3发酵液及菌丝的处理

液体发酵7 d后，将发酵液进行真空抽滤，分离菌丝体和发酵液。菌丝处理：菌丝放于干燥箱中烘干，将干菌丝放入研钵加少许石英砂研磨成粉末状。分别用100 mL乙酸乙酯浸泡菌丝，过夜后进行真空抽滤得到菌丝液。发酵液处理：对所得发酵液在80℃水浴锅中进行浓缩至原来体积的1/2，再加入等体积的乙酸乙酯放置1 d。将处理好的发酵液和菌丝液混合，用分液漏斗萃取分离，留乙酸乙酯相。用旋转蒸发仪去除乙酸乙酯，得到的浸膏用浓度为60%的乙醇浸泡溶解，留存备用。

1.4颜色反应初筛

利用盐酸-镁粉反应对产黄酮菌株进行初筛。取1 mL浸膏溶解液，加入1 mL浓盐酸和少量镁粉，观察颜色变化，若不明显可稍微加热。若有颜色反应，需进行单个菌种发酵培养进行二次初筛。经过2次初筛后，将有颜色反应的菌种，进行复筛。

1.5薄层层析法复筛

复筛包括制板、点样、层析、显色和Rf值的计算。首先，称取薄层层析硅胶12 g，羧甲基纤维素钠0.16 g，将它们倒入研钵中，加入40 mL蒸馏水，用研磨棒沿同一个方向研磨，研磨至糊状后，取适量加在层析板上，左右轻轻晃动层析板，使其在层析板上均匀分布，常温晾干后，放到100℃烘箱活化1 h，此即为薄层层析板；点样时，在距离薄层板一端1 cm处用铅笔轻轻划线，在线上等距离做两个记号，用毛细管在这两个位置上分别点芦丁标准品溶液和待测菌液；接着把薄层层析板放入装有扩展剂（无水乙醇与石油醚1∶1）的层析缸中层析；层析结束后用铅笔描出溶剂前沿，待薄层层析板干后，用浓氨水熏蒸显色检测层析效果；对待测菌液有层析斑点的薄层层析板计算Rf值。

1.6产黄酮内生真菌的形态学鉴定

用接种针挑取少量菌丝置于载玻片上，加1滴苯酚棉兰染色，并用针尖将菌丝分散开，盖好玻片即得载片标本，用显微镜观察菌丝的特征、孢子的形态，对照真菌鉴定手册[5]确定其分类地位。

1.7产黄酮能力测定

称取一定量的芦丁，干燥至重量恒定，精确称取20 mg，放入100 mL容量瓶中，加少量60%的乙醇使其充分溶解，再用60%乙醇定容至刻度线，震荡均匀，此时芦丁标准品浓度为0.2 mg/mL。然后分别量取芦丁标准液0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15 mL，将所取溶液置于25 ml的容量瓶中，分别加入60%的乙醇6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0 mL，取5%的亚硝酸钠溶液0.8 mL分别加入溶液，混合均匀，静置5 min再取10%的硝酸铝0.8 mL加入容量瓶中，混合均匀，静置5 min；再取1 mol/L的氢氧化钠6.5 mL加入容量瓶中，混合均匀静置12 min，用60%乙醇定容至刻度线。以60%乙醇溶液作为空白组，在510 nm处测定吸光度，将吸光值作为纵坐标，浓度作为横坐标，绘制标准曲线。

将1.3方法中制备的产黄酮菌株的代谢物溶液，从中取10 mL按芦丁测定吸光值的方法测出吸光度，根据标准曲线计算黄酮的含量。

2　结果与分析

2.1颜色反应初筛结果

前期从油茶样品中共分离得到的内生真菌24株，对每株菌分别命名，依次为COEF-1、COEF-2、…、COEF-24。

将24株内生菌3个为一组进行混合液体发酵，发酵后经处理，用于颜色反应，初筛结果如表1所示。在8组液体发酵的产物中，有2组盐酸-镁粉反应结果呈阳性的，分别是第3组、第5组，涉及到内生真菌COEF-7、COEF-8、COEF-9、COEF-13、COEF-14、COEF-15。对这6种内生真菌再进行单一菌种液体培养，培养后浓缩发酵液，其颜色反应结果如表2所示，COEF-8、COEF-13的代谢产物反应呈现阳性，提示在其生长过程中有可能产生黄酮类物质。

表1　第一次初筛结果

表2　第二次初筛结果

2.2薄层层析复筛结果

每个样品薄层层析重复3次，结果显示COEF-8和COEF-13在3次的重复试验中均有与标准品芦丁一致的层析斑点（表3），表明COEF-8和COEF-13极有可能产与芦丁结构类似的黄酮类化合物。

表3　薄层层析法复筛结果

2.3产黄酮内生真菌的形态学鉴定对油茶中产黄酮的内生真菌COEF-8和COEF-13制片后镜检结果如图1所示。COEF-8的孢子图片显示为典型的青霉属（Penicillium），分生孢子梗直立，顶端为扫帚状的分支；COEF-13的孢子图片显示其分生孢子梗短，形状为倒梨型，鉴定为链格孢属（Alternaria）。

2.4产黄酮的能力测定

以芦丁浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制芦丁标准曲线（图2），得到回归方程：Y=6.998 2X-0.028 8（R2=0.993 2），说明此图中芦丁吸光值与芦丁浓度（0～0.12 mg/mL）线性关系良好。

图1　COEF-8和COEF-13的显微图片

菌株COEF-8和菌株COEF-13经液态发酵后测得其吸光值为0.003和0.009，利用所得的回归方程计算得到黄酮浓度为0.004 5和0.005 4 mg/mL，所以初始菌株中产黄酮量分别为0.011 3和0.013 5 mg/mL。

图2　芦丁标准曲线

3　结论与讨论

黄酮是油茶中的活性成分之一，关于油茶黄酮的获取大多是以油茶叶、油茶饼粕、油茶壳等为原材料提取，这是传统的制备方法。而内生真菌存在于植物体内，通常能产生与植株相同或相似的次生代谢产物，若能筛选出产黄酮的内生真菌，则能为油茶黄酮的获得开辟一条新途径。

试验以前期从油茶中筛选出的内生真菌为对象，开展筛选工作。液体发酵培养时采用了菌种混合发酵的方法，缩小筛选范围，减小了筛选的盲目性，最终获得的2株菌株经形态学鉴定为链格孢属和青霉属。不仅油茶中存在能产黄酮的内生菌株，在其他植物中也同样筛选出了一些能产黄酮的内生真菌。李姝诺等[6]在对越橘内生真菌的研究中，筛选出了2株能产黄酮的内生真菌，经形态学鉴定，一株为细链格孢（Alternaria tenuissima），一株为无孢菌株。何映霞等[7]确定了珙桐中可产黄酮的内生真菌为烟曲霉种（Aspergillus fumigatus）。钱龙等[8]对银杏内生真菌进行研究，发现安培菌属的白粉菌寄生菌（Anpelomyces humuli）、茎点霉属的头状茎点霉（Phoma glomerata）和镰孢属的茄镰孢（Fusarium solani）具有产黄酮的能力。从这些研究中可以看出，在能够产黄酮的宿主植物中一般都能筛选出产黄酮的内生真菌，但产黄酮的内生真菌的种类并不是完全一样的，提示不同内生真菌产生的黄酮的种类可能存在区别。

黄酮是一大类的化合物，基于一个母体环可衍生出多种不同结构的黄酮类物质。产黄酮内生真菌的筛选一般都要经历初筛和复筛这两个阶段。初筛主要是颜色反应，如盐酸-镁粉反应、醋酸铅反应、三氯化铝反应等，不同的颜色反应可能提示不同结构的黄酮物质的存在，在试验中只选用了盐酸-镁粉反应为初筛的鉴别反应，这可能导致其他一些产黄酮内生真菌的遗漏，因此再进一步的研究中应多选取一些颜色反应作为鉴别的依据；复筛时主要通过薄层层析或高效液相色谱法检测内生真菌所产的次生代谢物是否是具有与标准品相似的结构，在越橘内生真菌次生代谢产物的研究中[6]，产黄酮的内生真菌经薄层层析均有两个斑点，其中一个斑点与标准品芦丁的斑点在同一水平位置；在绶草内生真菌的研究中[9]，发现了3株产黄酮的内生真菌，且其代谢产物在薄层层析中只有一个斑点，具有与标准品芦丁相同的迁移率。在本研究的复筛结果中，两种内生真菌在薄层层析中也只跑出了一个斑点，其Rf值与芦丁一致，说明这两种内生真菌所产的黄酮结构可能与芦丁类似，其产黄酮的能力通过分光光度法得到了较为确切的结果，来自青霉属的COEF-8产黄酮量为0.011 3 mg/mL，来自链格孢属的COEF-13产黄酮量稍高一点，为0.013 5 mg/mL，但二者均未达到工业化生产的要求。在今后的研究中，为提高产量可对其进行诱变处理。

[1]朱俊朋，罗 凡，王 超，等.水提—醇萃法提取油茶饼粕中茶皂素[J].食品工业，2016，37（1）：107-109.

[2]梁 帆，郭 华，周 玥.响应面法优化油茶籽仁黄酮提取工艺[J].食品安全质量检测学报，2015，6（6）：2084-2090.

[3]Zheng J H, Kang J C, Lei B X，et al.Diversity of endophytic fungi associated with Ginkgo iloba[J].Mycosystem，2013，32（4）：671-681.

[4]Zhou S L，Yan S Z，Wu Z Y，et al.Detection of endophytic fungi within foliar tissues of Camellia oleifera based on rDNA ITS sequences[J].Mycosystem，2013，32（5）：819-830.

[5]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学出版社，1979.

[6]李姝诺,，李亚东，王 琦.越橘产黄酮类化合物内生真菌的筛选[J].吉林农业大学学报，2009，31（5）：587-591.

[7]何映霞，冉雪琴，王嘉福.珙桐产黄酮内生真菌的分离和鉴定[J].贵州农业科学，2008，36（3）：3-6.

[8]钱 龙，杨明飞，冉雪琴，等.银杏产黄酮内生真菌的分离与鉴定[J].山地农业生物学报，2007，26（4）：305-310.

[9]刘紫英.产黄酮成分的绶草内生真菌的鉴定[J].菌物学报，2011，30（1）：133-137.

（责任编辑：夏亚男）

Primary Studies on Flavonoid-Producing Endophytic Fungi Isolated from Camellia oleifera

ZHANG Ting，ZUO Xue-Zhi，MA dan
（College of Bioengineering, Jingchu University of Technology, Jingmen 448000, PRC）

Endophytic fungi which were isolated from Camellia oleifera are cultured in the liquid medium.A lot of secondary metabolites were obtained by condensing the zymotic fluid and analyzed with color reaction and thin layer chromatography.Eventally 2 endophytic fungi that could produce flavonoid were obtained and classified as Penicillium and Alternaria according to the morphological charactersitic.Furthermore, the flaconoid content in fermentation liquid were determined as 0.0113 mg/mL and 0.0135 mg/mL respectively.

Camellia oleifera; endophytic fungi; flavonoid; Penicillium; Alternaria

S794.4

A

1006-060X（2016）11-0001-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.011.001

2016-09-02

湖北省教育厅科研项目（Q20134301）；校级科研基金项目（ZR201403）

张 婷（1980-），女，湖北襄阳市人，讲师，主要从事微生物资源利用研究。