SHH、Gli-1、MMP-2在胃癌组织中的表达及临床意义

陈世豪 唐 源 卞永生

1 承德医学院(承德 067000) 2 保定市第一医院(保定 071000)



·论著·

SHH、Gli-1、MMP-2在胃癌组织中的表达及临床意义

陈世豪1唐 源1卞永生2

1 承德医学院(承德 067000) 2 保定市第一医院(保定 071000)

目的 探讨胃癌组织中刺猬信号通路(Hedgehog signaling pathway, Hh)中的音猬因子(Sonic hedgehog, Shh)和胶质瘤相关癌基因同源物-1(Glioma-associated oncogene homolog -1, Gli-1)与金属基质蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2, MMP-2)的表达和临床意义。方法 采用免疫组织化学方法检测40例人胃癌组织、人胃息肉组织和40例正常胃黏膜组织中音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2蛋白的表达。结果 胃癌组织中音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2的阳性表达率分别为62.5%、67.5%、72.5%，高于胃息肉组织(阳性表达率分别为27.5%、37.5%、32.5%)和正常胃黏膜组织(阳性表达率分别为22.5%、17.5%、12.5%)(P<0.05)；以上三者的表达与患者性别、年龄、组织学类型无关(P>0.05)；而与分化程度、浸润深度、淋巴结转移相关(P<0.05)；音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2表达呈正相关。结论 刺猬信号通路可能通过某些机制可上调金属基质蛋白酶-2的表达，从而增强胃癌的侵袭性。联合检测胃癌组织中音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2的表达水平在一定程度上可以作为胃癌预后的客观参考指标。

胃癌 音猬因子；胶质瘤相关癌基因同源物-1；金属基质蛋白酶-2；免疫组织化学

在中国以及世界范围内，胃癌都是常见的高发性的恶性肿瘤。通过众多的研究结果可以得知，虽然胃癌的具体发病机制仍不明确，但胃癌的发生发展与包括慢性萎缩性胃炎、胃黏膜肠上皮化生等胃部慢性疾病密切相关，并且与遗传、饮食习惯、幽门螺杆菌感染等因素密切相关。由于胃癌早期发病不典型，缺乏较为敏感的早期诊断方法，所以患者就医时已为中晚期，预后很差。国内外近几年研究发现在胃癌组织中存在Hh信号通路的异常激活。MMP-2作为金属基质蛋白酶家族中的一员，在恶性肿瘤对周围组织的浸润以及转移中扮演重要的角色。但关于Hh信号通路的异常激活与MMP-2的表达二者之间是否存在某种联系，在过去的研究中仍然是空白。本研究通过选取Hh信号通路的两个关键因子，即上游因子Shh和Gli-1，以及MMP-2进行联合检测，观察并分析三者在胃癌组织中的关系以及三者的表达水平之间是否存在相关性，进一步研讨三者在胃癌发生、发展以及侵袭、转移中的作用和在临床诊治中的意义。

1 资料与方法

1.1 病例资料 收集保定市第一医院自2010年1月—2016年6月之间进行胃癌根治术并经过术后病理诊断确诊为胃腺癌的胃癌组织40例，胃镜下取材并经过病理诊断确诊为胃息肉的组织标本40例，另取正常胃黏膜组织40例为正常异体对照。其中胃癌病例，男24例，女16例，平均年龄为52.37 a。胃息肉病例，男27例，女13例，平均年龄49.13 a。正常胃黏膜取材中，男20例，女20例，平均年龄46.57 a。胃癌病例中经病理诊断证实无其它部位原发肿瘤，手术前均未进行任何放疗、化疗。胃癌病理分期依据国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会(UICC/AJCC)胃癌TNM分期标准(2010)，病理学检查依照Lauren分型分为弥漫型和肠型。所有实验标本均经过质量浓度为100 g/L的多聚甲醛溶液固定，并分批石蜡包埋，连续4～5 μm厚度切片。

1.2 试剂 实验所用一抗为兔抗人Shh多克隆抗体(BA2171)、兔抗人Gli-1多克隆抗体(MK2532)和兔抗人MMP-2(BA3716)抗体，均购自武汉博士德生物工程有限公司，实验所用二抗为多聚体抗兔IgG-HRP(SV0002)，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法 本实验采用免疫组织化学二步法进行检测。将石蜡包埋的组织切片依照常规进行脱蜡至水，抗原修复方法采用高压蒸锅水浴法，抗原修复完毕后滴加质量浓度为30 g/L的H2O2溶液，室温放置15min用于灭活内源性酶，之后PBS溶液冲洗3次，每次5min，冲洗完毕后滴加一抗，放置于4℃冰箱过夜孵育，孵育完毕后PBS溶液冲洗3次，每次5min，冲洗完毕后滴加二抗，在室温下孵育30min，孵育完毕后PBS溶液冲洗3次，每次5min，冲洗完毕后滴加新配制的DAB显色剂，在光学显微镜下观察显色，显色完毕后充分水洗，冲掉DAB显色剂，之后分别经过苏木素复染、质量浓度为1 g/L的盐酸酒精分化、质量浓度为10 g/L的氨水返蓝，之后梯度酒精脱水，最后中性树胶封片。结果判定使用已知为阳性的组织切片作为阳性对照片，使用已知为阴性的组织切片作为阴性对照片，对照组使用PBS溶液代替一抗作为阴性对照。

1.4 评定标准 Shh蛋白阳性定位于细胞膜或细胞浆，Gli-1蛋白阳性定位于细胞浆或细胞核中，MMP-2蛋白阳性定位于细胞膜或细胞浆中。在其相应部位若出现棕黄色或棕褐色颗粒，并且染色程度明显高于背景非特异性染色者，可判定为阳性细胞。根据阳性细胞所占的百分率以及染色强度这两项指标来对染色结果进行评价。①阳性细胞百分率：在每张组织切片中随机选取10个高倍视野，分别计数其阳性细胞所占之百分率，百分率小于10%者记为0分，百分率在10%～25%者记为1分，百分率在26%～50%者记为2分，百分率>50%者记为3分；②染色强度：高倍视野中无着色者记为0分，淡黄色着色者记为1分，棕黄色着色者记为2分，棕褐色着色者记为3分。将以上两项计分结果相加，<2分者判定为阴性(-)，≥2分者判定为阳性(+)。分别由病理科两位医师进行盲法评价，以两者平均评分为每张切片的最终评分。

1.5 统计学分析 实验数据采用SPSS 19.0统计软件来进行统计学分析，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法；相关性分析采用非参数Spearman等级相关方法，进行P值检验，检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 Shh蛋白、Gli-1蛋白和MMP-2蛋白的表达情况 Shh蛋白阳性定位于细胞膜或细胞浆中。在胃癌组织中，Shh有62.5%(25/40)的胃癌标本为阳性，显著高于胃息肉组27.5%(11/40)和正常胃黏膜组22.5%(9/40)的阳性率(P<0.05)(图1～图3)。Gli-1蛋白阳性定位于细胞浆或细胞核中，有67.5%(27/40)的胃癌标本呈现阳性表达，胃息肉组阳性表达率为37.5%(15/40)，正常胃黏膜组的阳性表达率为17.5%(7/40)，差异有统计学意义(P<0.05) (图4～图6)。MMP-2蛋白阳性定位于细胞膜或细胞浆中。有72.5%(29/40)的胃癌标本呈现MMP-2染色阳性，胃息肉组阳性率为32.5%(13/40)，正常胃黏膜组为12.5%(7/40)，差异有统计学意义(P<0.05)(图7～图9)。

图1 Shh在正常胃黏膜组织中的表达(免疫组化染色×200)

图2 Shh在胃息肉组织中的表达(免疫组化染色×40)

图3 Shh在胃癌组织中的表达(免疫组化染色×200)

图4 Gli-1在正常胃黏膜组织中的表达(免疫组化染色×200)

图5 Gli-1在胃息肉组织中的表达(免疫组化染色×200)

2.2 胃癌组织中Shh、Gli-1和MMP-2的表达与临床病理学指标之间的关系 根据实验结果以及统计学分析，Shh、Gli-1、MMP-2的表达水平与性别、年龄以及组织学类型不存在相关性(P>0.05)，其中差异无统计学意义(表1)。Shh、Gli-1、MMP-2的表达水平与胃癌的浸润深度、有无淋巴结转移以及pTNM分期有关(P<0.05)，其中差异有统计学意义(表2)。其中T3～T4期组的阳性表达率显著高于T1～T2期组，同样，淋巴结转移组阳性表达率也显著高于无淋巴结转移组(P<0.05)。

图6 Gli-1在胃癌组织中的表达(免疫组化染色×200)

图7 MMP-2在正常胃黏膜组织中的表达(免疫组化染色×200)

图8 MMP-2在胃息肉组织中的表达(免疫组化染色×200)

2.3 胃癌组织中Shh、Gli-1、MMP-2表达之间的关系 通过Spearman等级相关性分析发现，Shh与Gli-1二者之间的表达呈正相关关系，r=0.521，P<0.05，Shh与MMP-2二者的表达呈正相关关系，r=0.533，P<0.05，Gli-1与MMP-2二者的表达呈正相关关系，r=0.531，P<0.05。

3 讨 论

Hh基因是1980年Nusslein等研究人员在研究果蝇的基因突变时发现的，此后许多研究认为其不仅在胚胎发育以及器官发育中起到重要的作用，而且Hh信号通路的破坏也是多种疾病发生的罪魁祸首[1]。哺乳动物中Hh家族包括三种同系物：Sonic Hh(Shh)、Indian Hh(Ihh)和Desert Hh(Dhh)[2]，其中很大比例的研究是以Shh为对象所实现的。在成熟的组织器官当中，Hh信号通路为关闭或低表达状态，在某些异常情况下，Hh信号通路异常激活，成熟组织中的Hh信号通路呈现高水平表达状态，这种异常激活的形式被认为极有可能与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。

图9 MMP-2在胃癌组织中的表达(免疫组化染色×200)

参与Hh信号传导的主要为Patched(Ptch)蛋白、Smoothened(Smo)蛋白、胶质瘤相关癌基因同源物(Glioma-associated oncogene homolog, Gli)与Hh信号复合体(HSC)。目前研究界认为，Hh信号通路处于静止状态时，Ptch蛋白结合Smo蛋白，使Smo蛋白的活性受到抑制，HSC以非全长的形式作为转录抑制子；当Hh信号通路激活时，Hh配体首先与Ptch蛋白竞争性结合，从而使Smo蛋白得到活化，活化的Smo蛋白激活STK36丝氨酸-酪氨酸激酶，抑制HSC的降解并释放Gli， Gli进入细胞核从而激活靶基因[3]。

表1 胃癌Shh、Gli-1和MMP-2表达与临床病理参数的关系 例(%)

表2 胃癌组织中Shh、Gli-1和MMP-2与临床病理参数的关系 例(%)

Ma等[4]研究发现在胃腺癌中Shh与Gli-1的表达水平往往呈现高表达水平且Shh与Gli-1的表达水平与其恶变程度呈负相关。此外另有研究发现在胃腺癌中Shh、Gli-1的表达水平与胃癌的侵袭性以及预后相关。Yoo等[5]研究发现异常激活的Hh信号通路能够促进MMP-9的表达及活化，从而使胃癌细胞获得更强的侵袭能力。通过此次实验结果，能够得知胃癌组中的Shh与Gli-1的阳性表达水平要显著高于胃息肉组以及正常胃黏膜组，这一点说明胃癌组织中存在Hh信号通路的异常激活并呈现高水平表达状态，提示在胃癌的发生以及发展的过程中存在Hh信号通路的参与。另外在胃癌组织中，低分化组中的阳性表达率较高中分化组显著增高，并且T3+T4期组中的阳性表达率较T1+T2期组也显著增高，同样，淋巴结转移组的阳性表达率也要明显高于无淋巴结转移组，这一点提示Hh信号通路的表达水平与胃癌的恶性程度相关。

金属基质蛋白酶家族是一类锌离子依赖性内肽酶家族，其主要作用是降解细胞外基质(ECM)从而维持细胞外基质的稳定状态[6]，MMP-2便是其家族中的一员，活化后的MMP-2可分解IV型胶原酶从而使细胞外基质遭到降解[7]，基底膜的完整性遭到破坏，破坏基底膜的完整性，使肿瘤获得更高的侵袭、转移能力。通过本研究可以得知，胃癌组中的MMP-2阳性表达率明显高于胃息肉组以及正常胃黏膜组且MMP-2的阳性表达率与胃癌的分化程度、浸润深度以及淋巴结转移相关，提示MMP-2与胃癌的恶性程度以及侵袭能力有关。统计学分析发现，Shh与Gli-1的表达与MMP-2的表达为正相关，这一点提示Hh信号通路异常表达能够上调MMP-2的表达。当前针对Hh信号通路是如何调节MMP-2表达的具体机制仍然未知，相关的研究仍不充分，但有研究发现[8]Hh信号通路能够通过TGF-β1使MMP-2 的表达上调。又有研究发现[9]Shh可激活Rho-ROCK途径从而促进血管的发生，由此推测Hh信号通路可能与新生血管的生成相关。Shapiro等[10]研究表明MMP-2能够增加内皮细胞的迁移和VEGF的释放，刺激血管形成，另外，有研究发现在胃癌组织中MMP-2的表达与血管拟态形成相关[11]。据此我们可猜想在肿瘤的发生中Hh信号通路可诱导新生血管形成，增强了肿瘤的侵袭、转移能力。

综上所述，Shh、Gli-1和MMP-2在胃癌组织中表现出高表达状态且其表达水平与胃癌的分化程度、侵袭深度以及有无淋巴结转移之间存在相关性，而且Shh和Gli-1的表达也分别与MMP-2的表达呈正相关。由此我们可以推测在胃癌的发生发展中，有异常激活的Hh信号通路的参与，并且Hh信号通路可上调MMP-2的表达从而增强胃癌的侵袭能力。联合检测胃癌组织中Shh、Gli-1和MMP-2的表达水平可在今后的临床诊治中作为一种评价胃癌预后的客观指标，另外Hh信号通路也可作为胃癌靶点治疗的一个新的靶点，为今后的临床诊治提供了一个新的思路。

[1] ROBBINS DJ, FEI DL, RIOBO NA. The hedgehog signal transduction network[J]. Sci Sig, 2012,5(246):866- 871.

[2] JMY NG, CURRAN T. The hdegehog’s tale:developing strategies for targeting cancer[J]. Nature Rev Cancer,2011,11(7):493-501.

[3] JIANG J,HUI CC.Hedgehog signaling in development and cancer[J]. Dev Cell,2008,15(6):801-812.

[4] MA XL,SUN HJ,WANG SH,et al.Study of Sonic hedgehog signaling pathway related molecules in gastric carcinoma[J]. World Gastroenterol,2006,12(25):3965-3969.

[5] YOO YA,KANG MH,LEE JH,et al.Sonic hedgehog pathway promotes metastasis and lymphangiogenesis via activation of Akt,EMT,and MMP-9 pathway in gastric cancer[J]. Cancer Res,2011,71(22):7061-7070.

[6] BACK M, KETELHUTH DF, AGEWALL S. Matrix metalloproteinases in atherothrombosis[J]. Prog Cardiovase Dis,2010,52(5):410- 428.

[7] 刘倩, 吴小翎, 罗红春. MMP-2在胃癌组织中的表达及其与微血管生成和淋巴结转移的关系[J]. 重庆医学, 2012, 41(13):1262-1264.

[8] 王斯璐, 吴存造, 潘晓东,等. 白藜芦醇对TGF-β1介导的肾小管上皮细胞表型转化和Hedgehog信号的影响[J]. 浙江医学, 2015, 37(7):536-538.

[9] CHINCHILLA P, XIAO L, KAZANIETZ MG, et al. Hedgehog proteins activate pro-angiogenic responses in endothelial cells through non-canonical signaling pathways[J]. Cell Cycle,2010,9(3):570-579.

[10] SHAPIRO S, KHODALEV O, BITTERMAN H, et al. Different activation forms of MMP-2 oppositely affect the fate of endothelial cells[J]. Am J Physiol Cell Physiol,2010,298(4):942-951.

[11] 廖世平, 高青. 血管生成拟态及相关蛋白Mig-7、MMP-2在胃癌组织中的表达及临床意义[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2013, 29(2):194-196.

Expression and clinical significance of Shh,Gli-1 and MMP-2 in gastric cancer

Chen Shihao，Tang Yuan.

Chengde Medical College, Chengde 067000,China

Bian Yongsheng.

Baoding First Hospital, Baoding 071000,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of Sonic hedgehog(Shh), Glioma-associated oncogene homolog -1(Gli-1) and Matrix metalloproteinase-2(MMP-2) in gastric cancer.Shh and Gli-1 are the molecules of Hedgehog(Hh) signaling pathway. MMP-2 is the member of matrix metalloproteinase family. Methods The expression of Shh,Gli-1 and MMP-2 proteins was examined by immunohistochemistry in the human gastric cancer tissues and the human gastric polyp and the normal gastric mucosa tissues of 40 cases. Results The positive expression rates of Shh,Gli-1 and MMP-2 in gastric cancer were 62.5%,67.5% and 72.5% respectively, which were significantly higher than those in the gastric polyp tissues (the positive expression rates were 27.5%,37.5% and 32.5% respectively) and normal gastric mucosa tissues (the positive expression rates were 22.5%,17.5% and 12.5% respectively),P<0.05.The expression of Shh,Gli-1 and MMP-2 was not correlated with the sex,age or histological type(P>0.05),but was correlated with depth of invasion,differentiation level and lymphonode metastasis in gastric cancer(P<0.05). The expression of Shh and Gli-1 was positive correlated with MMP-2. Conclusion Hedgehog(Hh)signaling pathway may have great effects on enhancing the invasive ability of gastric cancer by upregulating MMP-2 protein through some unknown mechanisms.The combined detection of the expression level of Shh,Gli-1 and MMP-2 in gastric cancer tissues might be used as an objective references for assessing the prognosis of gastric cancer.

Gastric cancer;Sonic hedgehog;Glioma-associated oncogene homolog -1;Matrix metalloproteinase-2;Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.06.001

2016- 09-13)