微生物固定化法降解含油废水研究

刘俊良，刘欣雨，梁天宇

（西北民族大学化工学院，甘肃兰州730030）

微生物固定化法降解含油废水研究

刘俊良，刘欣雨，梁天宇

（西北民族大学化工学院，甘肃兰州730030）

在相同的环境条件下，研究以聚乙烯醇（PVA）与海藻酸钠（SA）以及聚丙烯酰胺（PAM）与海藻酸钠为材料制成的固定化微生物小球对水中石油的降解效果.结果表明；在七天的培养实验中，以PVA为主要材料制成的固定化微生物小球对石油的降解率为80.09%；以PAM为主要材料对石油的降解率为74.40%.以聚乙烯醇与海藻酸钠制成的微生物小球对石油的降解效果要优于聚丙烯酰胺与海藻酸钠.

微生物固定化；微生物数量；降油率

石油是一种重要的能源物质，随着国内经济的快速发展，石油的需求量越来越大.但是在其运输、储存和使用的过程中，往往因为发生意外事故造成泄漏而污染环境.水与人类的生活息息相关，被石油污染后水体功能退化、质量下降，将会对人类健康及自然环境造成持久性的破坏［1－2］.微生物修复技术是一种新兴实用的污染物治理技术［3］，具有成本低、简便高效、环境影响小等优点，适用于石油污染的治理，因而具有广阔的发展前景.

近年来，微生物固定化技术由于其使用原料易得、价格低廉、操作简单、对微生物毒副作用小而得到人们的关注.廖泽君［4］使用海藻酸钠-聚丙烯酰胺为固定化材料固定嗜酸性氧化亚铁硫杆菌进行微生物活性的研究；刘晓伟［5］使用活性炭为固定化材料固定氧化亚铁硫杆菌脱除SO2.从固定化技术现状来看，聚乙烯醇和海藻酸钠是微生物固定化技术中使用最为广泛的材料，多用于微生物活性的增效研究或用于脱硫等的实验室研究，在使用对象和现场应用方面均需要进一步扩展［6－9］.

本文用聚乙烯醇与海藻酸钠以及聚丙烯酰胺与海藻酸钠为包埋材料固定石油降解菌，制作两种固定化微生物小球对含油废水进行降解研究，并对比两种小球成型效果和微生物活性，探讨两种材料固定化在含油废水中的应用，对今后固定化微生物降解含油废水的研究应用提供重要的参考依据.

1 实验材料

1.1 油样来源

所用原油来自兰州石化厂油料，将原油溶于正己烷，在水浴锅中于68℃下加热，正己烷蒸发完全后得到标准油样品，于干燥环境中保存备用.

1.2 菌种来源

所用4株菌株均由西北民族大学实验中心微生物实验室前期实验分离纯化而得［9－10］，分别为：A6铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、AL鲁菲不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）、BS芽孢杆菌（Bacillus）、BSS枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），对石油都具有一定的降解作用［10－11］.

1.3 试剂与培养基

正己烷：色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；硼酸、无水氯化钙：分析纯（烟台市双双化工有限公司）；海藻酸钠：化学纯（天津市光复精细化工研究所）；聚乙烯醇（1750±50）、聚丙烯酰胺（1750±50）：分析纯（山东西亚化学工业有限公司）；营养肉汤培养基（杭州微生物试剂有限公司）.

1.4 仪器与设备

S·SW-CJ-ZF超净工作台（上海跃进医疗器械厂）、DHP-9160B智能型电热恒温培养箱（上海琅玕实验设备有限公司）；ZWY-200D全温震荡培养箱（上海智诚分析仪器制造有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；HH-6恒温水浴锅（金坛市恒丰仪器制造有限公司）；TU-1901紫外分光光度计（北京普析通用仪器责任有限公司）；ZJL-200菌落计数分析仪（北京先驱威锋技术开发公司）.

2 实验方法

2.1 混合菌剂的制备

把A6、AL、BS、BSS这四株菌分别使用营养肉汤培养基在37℃下恒温振荡培养24h［13］，将菌液按1︰1︰1︰1的体积混合制成混合菌液，置于5℃的环境中保存备用.

2.2 固定化微生物小球的制备

称取1.0g聚乙烯醇与0.5g海藻酸钠于100mL烧杯中，加入50mL蒸馏水浸泡12h，经过高压蒸汽灭菌后制成凝胶剂［14］.待凝胶剂冷却至35℃左右时，加入10mL预先制备好的混合菌液，搅拌均匀后，逐滴滴入饱和氯化钙硼酸溶液中成球，浸泡10h后取出固定化微生物小球，用无菌水冲洗药剂后收集备用.称取0.5g聚丙烯酰胺与海藻酸钠1g，采用相同方法制成含有混合菌液的凝胶剂后滴入氯化钙溶液成球.

2.3 标准油标准曲线的绘制

准确称取0mg、2mg、4mg、6mg、8mg、10mg的标准油，分别使用正己烷溶解后移入6个标记好的100mL容量瓶中，添加正己烷定容至刻度线后得到系列的油含量分别为0mg·L－1、20mg·L－1、40mg·L－1、60mg·L－1、80mg·L－1、100mg·L－1.使用紫外分光光度法，在225nm波长处以正己烷作为参比［15］，测定出系列油的吸光度，即可绘制出标准油的标准曲线.

2.4 降油率的测定

首先取四个100mL锥形瓶，分别加入10g由聚乙烯醇与海藻酸钠制成的固定化微生物小球、20 mL营养肉汤培养基、20mL无菌水和0.1g标准油，置于37℃的恒温摇床中培养.然后将聚丙烯酰胺和海藻酸钠制得的固定化微生物小球作同样的处理.培养第一天分别取样测定两种材料的初始油浓度.在培养的第三天、第五天、第七天取样测定两种材料的剩余油浓度.

将锥形瓶中的小球过滤后剩余的液体倒入分液漏斗，再加入正己烷，静置12h萃取.萃取结束后液体分层，培养基及细菌代谢物等物质于下层，溶有石油的正己烷于上层.取上层液体于100mL容量瓶，加入正己烷定容后，使用紫外可见分光光度计测定其吸光度.根据所测得的吸光度和标准曲线，计算出培养至第三天、第五天、第七天时的剩余油浓度，再根据公式计算出降油率.

降油率及油浓度计算公式如下：

公式（1）中c为油浓度，c0为初始油浓度，单位为mg·L－1，计算公式如下：

公式（2）中y为吸光度值；单位为Abs.

2.5 微生物数量的测定

用移液管吸取萃取后的下层液体1mL，移入已经灭菌的试管中，再加入9mL无菌水震荡混匀.取10－4～10－7的稀释倍数进行梯度稀释，使用稀释液涂已标记好稀释倍数的平板［13］，置于37℃的恒温培养箱中培养24h，次日取出测定微生物数量.

3 结果与分析

3.1 油的标准曲线

用紫外分光光度计在225nm波长处测定系列标准油后得到的吸光度值绘制的标准油标准曲线见图1.得到相关关系式为y＝0.0184x＋0.0371，其中y表示不同油浓度所测得吸光度Abs，x表示所测得不同吸光度所对应的油浓度mg·L－1；相关系数R2＝0.9904，线性关系良好.

图1 油标准曲线

3.2 两种材料制成的小球

图2 由PVA与SA制成的固定化微生物小球

图3 由PAM与SA制成的固定化微生物小球

两种不同材料所制成的固定化微生物小球见图2、图3.图2中所示为以PVA与SA为材料制成的固定化微生物小球，图3所示为以PAM与SA为材料制成的固定化微生物小球.从两个图中可以看出，以PVA为主要材料的固定化微生物小球相比于PAM，球的形状饱满圆润且稍有透明，成型后大小几乎一致.以PAM为主要材料制成的固定化微生物小球则存在成型状态不好、大小不一、易粘连的问题.3.3 两种材料的降油率及微生物数量关系

通过在锥形瓶中模拟降解环境，得到七天内两种不同材料的降油率对比见表1.同时测定的微生物数量随着培养天数的变化曲线见图2所示.

从表1中可以看出，两种材料的降油率随着培养天数的增加也随之增长，增长趋势相接近.在前三天两种材料的降油率都能增长至60%以上，随后增长趋势放缓.至第七天为止，以PVA与SA为包埋材料制成固定化微生物小球的降油率为80.09%.另一组包埋材料为PAM与SA，降油率为74.40%.两种材料相对比，以PVA为主的固定化材料制成的固定化微生物小球在模拟环境中的降油率要高于以PAM为主的固定化材料［9］.

表1 两种不同材料的降油率

通过图4可知，在加入两种不同材料制作的固定微生物小球的模拟环境中，微生物的数量变化趋势表现为PVA＋SA，显著较PAM＋SA高21%，表现出更强的生物活性.微生物生长趋势前三天中，微生物的数量快速增长，其原因为新加入的细菌在没有竞争和其他干扰的情况下，大量通过石油作为碳源和能源大量繁殖［12］.后四天，由于前期微生物大量繁殖产生了大量代谢物质，加之石油被降解成其他次级产物后微生物的碳源与能源不足，影响了微生物的繁殖，微生物数量开始缓慢地下降，反映了三天后降油率的缓慢提高趋势.

图4 微生物数量

4 结论

以PVA与PAM为主要材料制成的两种固定化微生物小球为研究对象，初步探讨了在七天的模拟环境中对石油的降解效果.结果表明，以PVA为主要材料制成的固定化微生物小球在成型以及大小形状上要优于PAM；其第七天的降油率为80.09%，也要高于PAM的74.40%.从微生物的数量方面进行分析，虽然它们增长减少的趋势相接近，但是PVA小球的微生物数量一直高于PAM，表现出更强的生物活性，这也解释了其在七天的实验中降油效果优于PAM［13］.可见，PVA与PAM虽然都能作为包埋材料对微生物进行固定用于降解水中的石油，但PVA的降油效果优于PAM，对进一步研究固定化微生物降解水中石油提供了参考依据.

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X703.1

A

1009-2102（2016）03-0016-05

2016-08-02

西北民族大学国家级大学生创新创业训练计划资助项目（项目编号：201610742058）.

刘俊良（1994—），男，广西南宁人.