滇橄榄对人口腔唾液流率、pH及细菌的影响研究

高 茜,谢 颖,黄海涛,倪红梅,李雪梅,管 莹,米其利,夭建华,*

(1.云南中烟工业有限责任公司,云南昆明 650106; 2.云南中医学院,云南昆明 650500)



滇橄榄对人口腔唾液流率、pH及细菌的影响研究

高 茜1,谢 颖2,黄海涛1,倪红梅1,李雪梅1,管 莹1,米其利1,夭建华1,*

(1.云南中烟工业有限责任公司,云南昆明 650106; 2.云南中医学院,云南昆明 650500)

目的:研究滇橄榄对人体口腔唾液流率、pH及口腔细菌的影响。方法:分时段采集10名志愿者咀嚼滇橄榄前、咀嚼滇橄榄期间、咀嚼滇橄榄后的唾液,检测志愿者唾液流率及pH的变化,同时采用荧光定量PCR实验法检测唾液中的总细菌及变形链球菌含量。结果:与咀嚼前相比,咀嚼滇橄榄后志愿者分泌唾液的量显著增加,唾液的pH先降低后升高,口腔内细菌及变形链球菌的数目有所减少。结论:滇橄榄有促进人体口腔唾液分泌的作用,可以有效减少口腔内的细菌总数及变形链球菌数量,有一定预防龋齿的效果。

滇橄榄,唾液流率,荧光定量PCR实验,龋齿

口腔是一个复杂的生态环境,唾液对于维持口腔内环境稳态起着至关重要的作用[1]。目前研究发现干燥综合征(SS)、药物、放射性治疗、糖尿病、高血压等都可导致涎腺分泌功能减弱,唾液流率明显偏低[2-5]。唾液处在温暖、黑暗的口腔里,构成了病菌、病毒和其他菌类的理想生存环境[6]。变形链球菌为革兰氏染色阳性的球菌,是主要的致龋菌,可促进菌斑的形成,从而导致龋齿的形成[7-8]。

滇橄榄又名余甘果,系大戟科叶下珠属植物余甘子(PhyllanthusemblicaLinn)的干燥成熟果实[9]。滇橄榄果实营养丰富,含有12种维生素、16种微量元素、16种氨基酸、有机酸、蛋白质、多酚、糖类等[10]。滇橄榄果实微寒微苦、甘、酸涩,具有健胃、消食、润肺、生津、收敛止泻、清热降火、解毒、抗氧化[11]、消滞止咳、解除疲劳等作用[12],另一方面,滇橄榄中含有丰富的余甘子酸、黏酸等成分,具有较强的抗菌作用[13]。文献表明用超临界CO2萃取的余甘子精油对常见食品污染菌具有很好的抑制作用[14]。

表1 实时荧光定量PCR引物及探针

Table 1 The primers and probes of Real-time quantitative PCR

引物及探针序列5′-3′变形链球菌Forwardprimer5′GCCTACAGCTCAGAGATGCTATTCT-3′Reverseprimer5′-GCCATACACCACTCATGAATTGA-3′探针FAM-TGGAAATGACGGTCGCCGTTATGAA-TAMRA引物及探针序列5′-3′细菌通用Forwardprimer5′-CGCTAGTAATCGTGGATCAGAATG-3′Reverseprimer5′-TGTGACGGGCGGTGTGTA-3′探针FAM-CACGGTGAATACGTTCCCGGGC-TAMRA

滇橄榄被联合国卫生组织制定为在全世界推广种植的三种保健植物之一[12]。近年来,对滇橄榄功能因子的研究及其相应功能的食品的开发越来越受到重视,但对于滇橄榄对人口腔生津作用、pH改变及抗菌作用的研究仍较少。本实验的主要目的是采用检测志愿者唾液流率的变化来研究滇橄榄的生津功效,并检测唾液的pH改变情况。同时采用了荧光定量PCR方法研究咀嚼滇橄榄对口腔内微生物的影响,以期为滇橄榄的开发使用提供一定的数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明市年龄为20～24岁的在校大学生健康人群,按照如下纳入、排除标准筛选实验对象。纳入标准:无全身系统性疾病;牙齿完整,咬合关系正常;口腔卫生良好,牙周健康;无未经治疗的龋齿;无口腔软组织疾病,无长期服药史;不使用含氟牙膏及漱口水;实验前2周全身及口腔局部未使用抗生素。排除标准:进行正畸治疗者;实验中需要服用抗菌药物者。按照以上纳入、排除标准,最终筛选出10名受试者,其中男性8名,女性2名。

滇橄榄果实 云南昆明;变形链球菌引物及探针、细菌通用引物及探针 Invitrogen;(表1)、荧光定量PCR试剂盒 KAPATMProbe;微生物裂解液 Takara;荧光定量PCR96孔板、荧光定量PCR96孔板膜 Biotipsci;无水乙醇 西陇化工;标准菌株:变形链球菌ATCC25175。

LC480荧光定量PCR系统 瑞士Roche公司;3-18K高速冷冻离心机 美国Sigma公司;HH-S26s恒温水浴锅 上海博讯公司;台式pH计，XS204分析天平 瑞士Mettler公司。

1.2 实验方法

1.2.1 唾液采集 采集唾液在安静的房间里进行,受试者平坐于椅上,上身稍前倾,手持带漏斗的量杯,将口内分泌的唾液外吐于量杯内,且受试者在实验前2周和实验期间未服用抗生素类药物及影响唾液分泌的药物,实验前2 h禁食、禁刷牙、漱口和吸烟。每位受试者分别给予(12±0.5) g滇橄榄果实一枚。采集唾液的方法为吐取法:使唾液在口底聚集,受试者每隔一定时间将其通过玻璃漏斗吐入15 mL离心管。采集唾液的总持续时间为22 min。具体时间段为:0～2、2～4、4～6、6～8、8～10、20～22 min。受试者开始咀嚼橄榄的时间为2 min,在10 min时停止咀嚼,从第10 min到第20 min中的这10 min为洗脱时间,咀嚼时间共持续8 min。

1.2.2 唾液流率及pH的测定 将采集好唾液称重并记录,计算不同时间段的平均唾液流率,并用pH计测量不同时间点的唾液pH。唾液流率计算公式如下:

每个时间段内唾液流率(g/min)=该时段内的唾液分泌重量(g)/收集时间(min)

1.2.3 DNA提取 实验方法参见文献[15]:取各个志愿者的唾液0.5 mL置于无菌1.5 mL EP管中,将EP管中唾液进行4 ℃离心10 min(12000 r/min),去除上清液,再加入50 μL微生物PCR专用裂解缓冲液于EP管中,混合均匀,然后置于80 ℃水浴锅中热变性15 min,低速离心1 min(1000 r/min),最后取上清液与无菌水按1∶8比例稀释后作为荧光定量PCR的模板。

1.2.4 荧光定量PCR实验 荧光定量PCR实验方法参见文献[16]:反应体系共20 μL,其中2×mix 10 μL、上下游引物各200 nmol/L、探针250 nmol/L、无菌水1.475 μL、模板(上清液)8 μL且混合均匀。反应条件参见文献[16]为:预变性95 ℃ 5 min,变性95 ℃ 15 s,退火/延伸 60 ℃ 1 min,进行45个循环。分别将通用菌(通用菌采用牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的混合菌)和变形链球菌标准品DNA按10倍梯度稀释作为模板进行定量PCR,制作标准曲线。每个样本检测均重复3次,取其平均值,每次反应均设空白对照。

2 结果与分析

2.1 唾液流率结果

志愿者在咀嚼滇橄榄之前(0～2 min)的平均静态唾液流率为1.16 g/min。在咀嚼滇橄榄后2 min(2～4 min)中唾液流率达到峰值(3.10 g/min),是静态唾液流率的2.7倍。随着咀嚼时间的延长,唾液流率逐渐降低,但仍高于静止状态,20～22 min的唾液流率(1.53 g/min)是静态唾液流率的1.32倍(图1)。

表2 唾液中变形链球菌数量变化趋势表

Table 2 Change trend of the number ofStreptococcusmutansin saliva

志愿者编号唾液中变形链球菌数量(不同时间段)0～2min2～4min4～6min6～8min8～10min20～22min1NNNNNN2035×102±001×102NNNNN3208×102±007×102NNNN046×102±006×1024036×102±002×102NNNNN5NNNNNN6040×102±000×102NNNN005×102±001×102714921×102±213×1023051×102±093×102NNN043×102±022×1028NNNNNN9051×102±000×102047×102±000×102NNN008×102±001×10210NNNNNN

图1 唾液流率变化图Fig.1 Change of saliva flow rate

注:N表示未检出。2.2 pH检测结果

志愿者在咀嚼滇橄榄之前的静态唾液的pH平均值为7.07。咀嚼滇橄榄后唾液pH呈下降趋势,在2～4 min降到最低值(4.17),随着咀嚼时间的延长,唾液pH又呈上升趋势,20～22 min时唾液pH达到所有时间段里的最高值(7.67),即停止咀嚼滇橄榄后的唾液pH为最大值,高于静止状态的pH(p<0.01)(图2)。

图2 唾液pH变化图Fig.2 pH change of saliva

2.3 荧光定量PCR的检测结果

变形链球菌标准品的标准曲线见图3,受试者唾液中的变形链球菌的含量变化见表2:在咀嚼滇橄榄之前,10个受试者唾液中有6个检测出变形链球菌,测出的唾液中变形链球菌平均含量为25.49×102个/mL,在咀嚼滇橄榄10 min后(20～22 min时段)有4个受试者唾液检出变形链球菌,变形链球菌平均含量为0.26×102个/mL,低于咀嚼滇橄榄之前的含量。说明在咀嚼滇橄榄之后,变形链球菌含量有所减少,而在咀嚼滇橄榄期间,仅有2～4 min时段有2个受试者唾液检出变形链球菌,其他时段均未检出。

图3 实时荧光定量PCR检测变形链球菌构建的标准曲线Fig.3 Standard curve of Streptococcus mutans for real-time quantitative PCR

总细菌标准品的标准曲线见图4,受试者唾液中的总细菌含量变化可由图5看出:在咀嚼滇橄榄之前,总细菌的数目是所有时间段里的最大值,在开始咀嚼滇橄榄的2 min内,总细菌数目迅速降到最低值,随着咀嚼时间的延长,细菌的数目有所波动,但在停止咀嚼滇橄榄10 min之后的细菌数目仍小于咀嚼滇橄榄之前。

图4 实时荧光定量PCR检测总细菌构建的标准曲线Fig.4 Standard curve of total bacterial for real-time quantitative PCR

图5 唾液中细菌数量变化趋势图Fig.5 Change trend of the number of total bacterial in saliva

3 结论与讨论

唾液有湿润口腔、调和食物、保持味觉的作用。人的舌头能在口腔中自由活动,全靠唾液的帮助,说话、进食都少不了它。所以也把唾液称为“口腔润滑剂”[17]。本实验通过观测受试者咀嚼滇橄榄前后唾液流率的变化,研究了滇橄榄对人体唾液分泌的影响。由图1 的唾液流率变化趋势图可以看出:咀嚼滇橄榄可有效刺激涎腺分泌唾液,随着咀嚼时间的延长,涎腺受到的有效刺激有所减少,故唾液流率呈缓慢下降的趋势,但仍高于静态唾液流率。唾液流率增加的原因有二,根据对志愿者唾液的pH检测结果,在开始咀嚼滇橄榄时pH骤然下降,主要原因是滇橄榄本身的性味为酸,其中含丰富的余甘子酸和黏酸等成分,从而导致味觉刺激分泌更多的唾液,二是咀嚼本身带来一定的机械刺激,也有促进唾液分泌的功效。总之,滇橄榄能有效刺激涎腺分泌唾液,有一定的生津润燥、治疗口干的作用。但由于本次实验条件所限,仅采集了受试者咀嚼后10 min后的唾液,至于滇橄榄是否能在更长时间内增加唾液的分泌及持续抑菌效果上仍待进一步研究。

龋病是口腔常见病和多发病,是牙齿在多种因素共同作用下,发生硬组织脱矿、有机物溶解和牙组织进行性破坏导致缺损的一种疾病[18]。而变形链球菌是口腔中常见的革兰氏阳性链球菌,也是口腔主要的致龋菌之一。荧光定量PCR的结果表明咀嚼滇橄榄过程中及咀嚼前后,口腔内的变形链球菌和细菌数目都有所减少。结合文献分析主要有如下原因:一是文献表明滇橄榄中含有大量抗菌物质可在体外对口腔中的微生物起到抑制作用:余甘子甲醇提取液对5个致病菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌)具有抗菌活性[9],另外有研究表明用超临界CO2萃取的余甘子精油对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希式杆菌、沙门氏菌、啤酒酵母、米曲霉等常见食品污染菌具有很好的抑制作用[14];滇橄榄中含丰富的余甘子酸、黏酸、没食子酸等成分,有一定的抗菌作用[19]。二是唾液流率的增加,对口腔起到一定的清洁作用,从而导致微生物数量的降低,有研究表明:人体口腔唾液中含有一类抗菌蛋白质为溶菌酶,具有抗菌消炎、增强机体免疫力等方面的药理作用,溶酶菌可以阻止龋齿的发生,故滇橄榄刺激人体口腔分泌唾液,有一定的抗菌作用[20]。三是由于变形链球菌的致龋原因主要是通过发酵多种碳水化合物产生乳酸,降低菌斑的pH,从而导致牙齿脱矿,在停止咀嚼滇橄榄后唾液的pH高于咀嚼滇橄榄之前的pH,说明在咀嚼滇橄榄之后,使咀嚼滇橄榄使口腔内环境稍微偏碱性,从而起到一个长时间的抗龋作用[21]。这三个原因的共同作用,导致了本文实验检测出的总细菌及变形链球菌的数量在滇橄榄咀嚼中及咀嚼后均有所减少。

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Effect of theFructusphyllanthion the human saliva flow rate,pH and bacterial

GAO Qian1,XIE Ying2,HUANG Hai-tao1,NI Hong-mei1,LI Xue-mei1,GUAN Ying1,MI Qi-li1,YAO Jian-hua1，*

(1.China Tobacco Yunnan industrial Corporate Limited,Kunmin 650106,China； 2.Yunnan University of TCM,Kunming 650500,China)

Objective:TostudytheeffectoftheFructus phyllanthionthehumansalivaflowrate,pHandbacterial.Methods:Thesalivabothbeforeandafterchewingform10volunteerswerecollected,thesalivaflowrateandpHchangeweredeterminedandthetotalbacteriaandStreptococcus mutanscontentinsalivaweredetectedusingreal-timePCRexperiment.Results:Comparedwiththeresultsbeforechewing,volunteerssalivaflowratewasincreasedsignificantlyafterchewingFructus phyllanthi,thepHwasdecreasedfirstandthenincreased,thenumberoftotalbacteriaandS. mutansweredecreased.Conclusion:Fructus phyllanthicouldpromotehumansalivasecretion,andeffectivelyreducethenumberoftotalbacteriaandS. mutansintheoral,therewasacertaineffectonthepreventionofdentalcaries.

Fructus phyllanthi;salivaflowrate;real-timePCR;dentalcaries

2016-04-27

高茜(1984-)，女，博士，助理研究员，研究方向：生物学，E-mail:gaoqian840905@163.com。

*通讯作者:夭建华(1968-)，女，博士，研究员，研究方向：烟草生物学,E-mail:jhyao_2007@126.com。

云南中烟工业有限责任公司项目(2015JC02)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)19-0352-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.060