利用酶标仪快速批量测定橡胶草中菊糖的含量

朱金霞，张源沛，郑国保，孔德杰，李 苗

(宁夏农林科学院农业生物技术研究中心,宁夏银川 750002)



利用酶标仪快速批量测定橡胶草中菊糖的含量

朱金霞，张源沛*，郑国保，孔德杰，李 苗

(宁夏农林科学院农业生物技术研究中心,宁夏银川 750002)

以橡胶草根为研究对象,采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法),利用酶标仪为检测仪器,建立了橡胶草中菊糖的快速测定方法。结果表明,酶标仪检测橡胶草根中总糖和还原糖含量的最佳实验条件:波长为550 nm、DNS显色剂用量为0.8 mL、沸水浴显色时间为8 min。同时,获得此条件下回归方程为A=0.6872C-0.0215(R2=0.9982),线性范围为0～2.2 mg/mL,加样回收率为96.67%～102.33%。该方法灵敏、稳定、重现性好,可在短时间内完成多个样品同时测定,该方法所得结果略高于分光光度计法。

酶标仪,3,5-二硝基水杨酸(DNS)法,橡胶草,菊糖

橡胶草(Taraxacumkok-saghyzRodin,TKS)为菊科(Compositae)蒲公英属多年生宿根草本植物,外形与蒲公英非常相似,又被称为俄罗斯蒲公英,但其根部含有天然橡胶[1],俗称橡胶草[2]。橡胶草除含胶乳外,还含有纤维素、菊糖等成分[3],因此,从橡胶草不但可获得战略资源橡胶,还可生产清洁能源乙醇和保健品菊糖。近年来,作为一种重要的巴西橡胶树替代作物、可再生能源植物及保健品开发植物,引起了各国专家的广泛关注和研究[3]。

菊糖多存在于菊科、龙胆科、桔梗科等植物中,主要是由D-呋喃果糖经1,2-糖苷键聚合而成的一种果聚糖,呈直链结构,其还原性末端连有一分子葡萄糖,每个菊糖分子约含30～50个果糖残基,植物中所含菊糖均为多种不同聚合度果聚糖的混合物[4]。菊糖具有水溶性膳食纤维和生物活性前体的生理功能,因而广泛应用于低热量、低糖、低脂食品中,具有多种保健功能和优良的食用价值,作为新型食品添加剂而受到国内外的高度重视[5-6]。资料报道[7],橡胶草根中菊糖占干重的40%左右,但其具体测定方法未见报道。

DNS比色法是测定还原糖的经典方法,得到了国内外研究者的普遍认可[8],实验中一般采用分光光度计进行测定[9-10],由于受到比色槽数量的限制,一次最多能测定4个样品,操作较繁琐,测定多个样品时,费时费力。酶标仪与分光光度计的测试原理相同,但具有样品槽多(96个)的特点,可在2 min内进行多波段多个样品的测定。本研究利用酶标仪为测试仪器,以果糖为标准品,以DNS溶液为显色剂,通过测定总糖水解液及还原糖提取液中的还原糖含量,进而获得菊糖含量。本实验所建立的方法灵敏、稳定、重现性好,可在2 min内完成96个样品的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

橡胶草 2013年从俄罗斯引进,在宁夏银川市贺兰县橡胶草种质驯化基地种植,以一年生橡胶草的根为实验材料。

结晶酚,亚硫酸氢钠,酒石酸钾钠,氢氧化钠,3,5-二硝基水杨酸,果糖,盐酸 国药集团化学试剂有限公司,分析纯。

伯乐Bio-rad xMark酶标仪 时代联想生物科技有限公司;Avanti J-26s×P台式离心机 贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司;HH-6电热恒温水浴锅 无锡沃信仪器有限公司;DHG9013AS电热鼓风干燥箱 宁波艾德生仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂的配制方法及浓度 DNS显色溶液的配制方法见参考文献[11];果糖标准溶液浓度为1.0 mg/mL,配制方法见参考文献[12]。

1.2.2 还原糖含量的测定 采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定还原糖供试溶液及总糖降解后溶液中还原糖的含量。

1.2.3 橡胶草预处理 预处理流程如下:新鲜橡胶草根→洗净→烘干(60 ℃,48 h)→粉碎(过60目)。

1.2.4 测试溶液的制备 还原糖供试溶液制备流程如下:称取预处理后样品粉末1.0 g→加25 mL蒸馏水→热浸(沸水浴)30 min→过滤→滤液定容于1000 mL→DNS溶液显色5 min→酶标仪测定糖含量。总糖供试溶液制备流程如下:称取预处理后样品粉末1.0 g→加入25 mL的2.0%盐酸溶液→热浸(沸水浴)30 min→调pH于7.0→脱色→过滤→滤液定容于1000 mL→DNS溶液显色5 min→酶标仪测定糖含量。

1.2.5 取样 对酶标板96个微孔进行编号,并移取250 μL待测试溶液于酶标板的微孔中,每个微孔可移取一个测试样品,最多一次可添加96个样品溶液,进行同时测试。

1.3 测定条件的确定

1.3.1 检测波长的确定 果糖标准溶液、还原糖和总糖供试溶液1.0 mL,经DNS溶液显色5 min后,分别在200～1000 nm波长范围内测其吸光度值。

1.3.2 DNS显色时间的确定 果糖标准溶液1.0 mL,加入DNS显色溶液,分别反应2、4、6、8、10、12、14 min后,以DNS显色剂调零,在一定波长处测定吸光度值。

1.3.3 DNS用量的确定 果糖标准溶液1.0 mL,分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的DNS溶液显色后,以DNS显色剂调零,在一定波长处测定吸光度值。

1.4 样品测定方法

1.4.1 标准曲线的绘制 分别准确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的果糖标准溶液,加蒸馏水至2.0 mL,摇匀,经显色反应后。在一定波长处测定吸光度值,以糖浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。

1.4.2 样品的显色及测定 准确吸取上述供试溶液1.0 mL于25 mL的具塞试管中,加入DNS显色剂1.0 mL,摇匀,沸水浴中热浸显色5 min,迅速用自来水冷却至室温,再加入9.0 mL蒸馏水,在一定波长处测定吸光度值。根据对照品溶液的回归方程计算糖含量。

菊糖含量(g)=总糖含量(g)-还原糖含量(g);

菊糖提取率(%)=菊糖含量(g)/试样重量(g)×100。

1.5 方法学考察

1.5.1 稳定性实验 取还原糖供试溶液、总糖供试溶液各1.0 mL,经显色反应后,分别放置0、0.5、1.0、1.5、2.0、12.0 h后进行测定。

1.5.2 回收率实验 精密吸取0.5 mL总糖供试溶液于6支试管中,各精密加入0.3 mL和0.6 mL的果糖对照品溶液,并分别用蒸馏水稀释至2 mL,摇匀,经显色反应后,在一定波长处测定吸光度值。

1.6 数据统计及分析

利用excel 2003作图,利用SPSS 19.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 样品溶液在不同检测波长下吸光度值的变化规律

将标准溶液、还原糖溶液、总糖溶液和空白对照溶液分别与DNS试剂进行显色反应后,在文献报道[11-14]的常规波长(480～600 nm)范围内进行多波段扫描,不同溶液的吸光度值经空白对照溶液调零后,结果如图1所示。

图1 不同检测波长下各溶液吸光度值的变化规律Fig.1 The absorbance of different solvent under different detection wavelength

表1 不同检测波长下标准曲线的回归方程、相关系数及菊糖的提取率

Table 1 Regression equations,correlation coefficient and the content of the inulin under different wavelength

检测波长(nm)回归方程相关系数菊糖提取率均值(%)480A=13989C-01390R2=095764456EF490A=13442C-00890R2=098274365I500A=12336C-00543R2=099244410H510A=11057C-00386R2=099554429G520A=09840C-00290R2=099694433G530A=08594C-00227R2=099754492CD540A=07376C-00183R2=099784465E550A=06872C-00215R2=099824487D560A=05357C-00122R2=099814487D570A=04506C-00110R2=099784561A580A=03812C-00088R2=099814452F590A=03137C-00080R2=099784498C600A=02596C-00064R2=099804528B

注:菊糖提取率均值数据后大写字母相同表示在p<0.01水平无极显著差异。从图1中可看出,在整个检测波长范围内,标准溶液调零后的吸光度值随着检测波长的增大呈显著下降趋势,数值介于0.256～1.258之间。还原糖和总糖溶液调零后的吸光度值变化不大,数值分别介于0.028～0.147和0.490～0.610之间。波长低于520 nm和高于590 nm时,空白对照溶液有较强的紫外吸收,这是由于显色剂本身具有颜色而获得的吸光值,这将会影响显色液吸光值的可靠性,因此分析波长应选择在530～580 nm之间,可避开显色剂本身对分析结果的干扰[12]。

2.2 检测波长的确定

对显色后的标准溶液进行多波段(100～1000 nm)扫描,然后选择干扰小,吸收较强的波长(480～600 nm)范围内进行每10 nm单位扫描一次,记录吸光度值。以果糖标准溶液浓度为横坐标,以吸光度值为纵坐标,绘制不同波长下的标准曲线,并进行回归分析,计算不同波长条件下菊糖提取率,结果如表1所示。

从表1中数据可看出,当果糖标准溶液浓度在0～2.2 mg/mL范围内,检测波长为480～600 nm时,标准曲线的线性关系均良好,计算得到其相应菊糖含量介于43.65%～45.61%之间。经方差分析,不同检测波长条件下的菊糖含量,部分测试结果之间呈极显著差异,p<0.01。因此在检测时选择不同的检测波长,对最终菊糖含量的测定结果影响较大。但在本实验中,考虑到检测波长为550 nm时,其线性相关系数最高,确定本实验的检测波长为550 nm。

2.3 显色时间的确定

3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热一定时间,可被还原成红棕色氨基化合物,共热时间的长短不同可影响生成的红棕色氨基化合物的量,进而影响吸光度值,结果如图2中所示。

图2 不同显色时间对吸光度值的影响Fig.2 The effect of the reaction timeon the figure of the absorbance

在检测波长为550 nm时,显色时间为2～14 min内,不同样品溶液其吸光度值变化趋势不同。显色反应时间较短(2～6 min)时,随着反应时间的增加,其吸光度值迅速增大。当反应时间长于8 min时,其吸光度值保持一个较平稳的水平。这是由于较短的显色反应时间,化学反应不完全,生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸有限,使得紫外吸收较弱。随着反应时间的延长,显色时间超过8 min时,化学反应发生较彻底,生成物的量基本保持不变,所以吸光度值变化不大。

2.4 DNS试剂用量的确定

DNS试剂用量与待测液中还原糖反应的是否完全,对检测结果影响显著,结果如图3所示。

图3 不同DNS用量对吸光度值的影响Fig.3 The effect of absorption on different DNS dosage

当DNS试剂用量小于0.8 mL时,溶液吸光度随DNS量的增加而迅速增大,当DNS试剂用量大于0.8 mL时,吸光度值则基本保持不变。因此,在考虑到节省能源及保护环境的情况下,DNS试剂的最佳用量为0.8 mL。

2.5 稳定性实验

不同种类溶液进行稳定性考察,对全面掌握溶液的稳定性,具有重要的参考意义,结果如图4所示。

从图4中可看出,三种测试溶液在显色后,放置2 h内,测定结果稳定,数值几乎没有变化。但随着时间的延长,当放置时间达到12 h时,其吸光度值迅速降低,因此进行大批量样品的还原糖含量测定时,可将放置2 h内显色液样品集中测定以提高工作效率。

图4 测试溶液显色后放置时间对测定结果的影响Fig.4 The effect of absorbance on storage time after color reaction

2.6 加样回收率实验

由表2可看出,果糖平均回收率为99.61%,RSD值为2.08%。因此,在此条件下进行测定时,结果是可靠的。

表2 加样回收率实验结果

Table 2 The results of recovery test

总糖样品量(mg)加入量(mg)测定值(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0239030005299667023903000541100670239030005339800023906000834991702390600084410038023906000853102339961208

2.7 酶标仪与分光光度计对橡胶草根中菊糖含量测试结果的比较

分别利用酶标仪和紫外分光光度计,测试同一批次的橡胶草根,菊糖百分含量如表3所示。

表3 酶标仪和分光光度计测定橡胶草根中菊糖的测试结果比较

Table 3 The results of insuls in the root ofTaraxacumkok-saghyzRodin

编号菊糖含量(%)酶标仪比色法分光光度计比色法148574686248394611347454799449134755548014624649324715平均值48484698

从表3中数据可看出,不同测试仪器对同一样品的测试结果不同,酶标仪的测试结果略高于分光光度计。

3 结论与讨论

菊糖广泛分布于菊科、龙胆科、桔梗科等属的植物中,橡胶草也为菊科植物,虽然有研究报道,橡胶草中含有菊糖,但到目前为止,没有进行橡胶草中菊糖含量测定的报道。通过此项研究,建立了橡胶草根中菊糖含量的快速和批量的测定方法,确定了其根中菊糖含量约为46.98%。

在诸多还原糖测定方法中,DNS比色法因其方便、快捷的特点而被广泛采用[9],但实验中一般采用紫外-分光光度计为测定仪器,由于其样品槽的有限,在批量和多波长测定时,所用时间较长,操作步骤繁琐,极大地影响了其工作效率。本研究所用的酶标仪,其测定原理与分光光度计相同,在合适的波长(200～1000 nm)范围内,均能达到良好的测定效果。本实验中所绘制的标准曲线R2最高可达0.9982,所得结果可以达到实验要求。

DNS法测定还原糖含量时波长的选择对测定结果的可靠性至关重要。文献中报道480[14]、500[15]、520[16]、530[17]、540[13,18]、550 nm[19]等波长均可作为测定波长。但是由于被测试溶液的特殊性及干扰因素的差异性,导致所选波长的不确定性。本研究扫描了480～600 nm波长下不同样品的吸光度值,发现总糖溶液和还原糖溶液在490～550 nm波长范围内吸光度值的变化趋势较一致,对菊糖测定结果有一定影响。但考虑到标准曲线的相关系数R2,最终确定检测波长为550 nm。

总糖溶液的提取采用的是盐酸溶液与固体样品一起加热,提取过程中,可能存在样品中一些可溶性纤维素和淀粉的水解,导致测定的总糖量较高,进而影响最终菊糖含量及提取率的数据。但这种提取方法对实验结果的影响程度,尚待进一步的验证。

[1]Jan B,van Beilen,Yves Poirier. Guayule and Russian Dandelion as Alternative Sources of Natural Rubber[J]. Critical Reviews in Biotechnology,2007,27:271-231.

[2]安锋,林位夫,谢贵水,等. 国内外巴西橡胶树替代作物及技术研发现状[J]. 热带作物学报,2012,33(6):1134-1141.

[3]梁素钰,王文帆,刘滨凡,等. 能源橡胶草的综合利用研究[J]. 能源研究与信息,2010,26(4):219-224,236.

[4]谭晓琼,董全,丁红梅. 功能保健食品菊糖的研究进展与发展前景[J]. 中国食物与营养,2007,(1):22-24.

[5]范三红,李静,王亚云,等. 超声波辅助复合酶提取菊糖工艺优化[J]. 食品科学,2015,36(4):23-28.

[6]曾小宇,罗登林,刘胜男,等. 菊糖的研究现状与开发前景[J]. 中国食品添加剂,2010,(4):222-227.

[7]张立群,张继川,孙树泉,等. 一种从蒲公英橡胶草中连续高效循环提取蒲公英橡胶和菊糖的方法:中国,201310311989.3[P/OL]. 2015-12-02. http://dbpub.cnki.net/grid2008/dbpub/detailaspx?dbname=SCPD2014&filename=CN103435720A.

[8]张成明,姜立,李十中. 酸水解对DNS法测定甜高粱中总糖的影响分析[J]. 农业机械学报,2014,45(9):199-203.

[9]张有林,张润光,王鑫腾. 甘薯采后生理、主要病害及贮藏技术研究[J]. 中国农业科学,2014,47(3):553-563.

[10]陆慧玲,胡飞. 酶法提取菊糖工艺的研究[J]. 食品工业科技,2006,(10):158-160.

[11]王文岭,黄雪松. DNS法测定木糖含量时最佳测定波长的选择[J]. 食品科学,2006,27(4):196-198.

[12]朱海霞,石瑛,张庆娜,等. 3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定马铃薯还原糖含量的研究[J]. 中国马铃薯,2005,19(5):266-269.

[13]李环,陆佳平,王登进. DNS法测定山楂片中还原糖含量的研究[J]. 食品工业科技,2013,34(18):75-77.

[14]刘忠义,汤海青,欧昌荣,等. 3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄酒中总糖含量的条件优化[J]. 核农学报,2013,27(11):1717-1723.

[15]邳楠,何聪芬,董银卯,等. 改进DNS比色法测定N-AcGA含量的研究[J]. 食品工业,2011,(2):92-95.

[16]巩莉,华颖,刘大群,等. 3,5-二硝基水杨酸法测定番茄废渣中糖分含量的研究[J]. 保鲜与加工,2014,14(3):37-42.

[18]姚嘉旻,姜岷,陈可泉,等. 改进DNS法测定玉米皮水解液中总糖含量[J]. 食品科技,2007,(11):165-168.

[19]赵凯,许鹏举,谷广烨. 3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究[J]. 食品科学,2008,29(8):534-536.

Rapid batch determination of the inulin inTaraxacumkok-saghyzRodin by enzyme mark instrument

ZHU Jin-xia,ZHANG Yuan-pei*,ZHENG Guo-bao,KONG De-jie,LI Miao

(Agricultural Biotechnology Center of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Yinchuan 750002,China)

Inordertoestablishtherapidbatchdeterminationmethod,whichcouldbeusedinthedeterminationoftheinulininTaraxacum kok-saghyzRodinrootbyenzymemarkinstrument,3,5-dinitrosalicylicAcidColorimetry(DNS)wasusedasthemainlymethods.Theresultsshowedthattheoptimumconditionsasfollows,thewavelengthwas550nm,thevolumeofcolorsolutionwas0.8mL,thecolorationtimewas8min.Underthiscondition,thecalibrationcurveofthismethodhadalinerrangefrom0to2.2mg/mLwitharegressionequationofA=0.6872C-0.0215(R2=0.9982),andthespottingrecoveryratewasfrom96.67%to102.33%.Themethodwassensitive,stableandreproducibilitytooperate,anditwassuitabletobeusedforrapidlyandquantitativelyanalysisofinulininTaraxacum kok-saghyzRodin.TheresultsoftheinulininTaraxacum kok-saghyzRodin,whichhadbeendetectedbyenzymeismorehigherthanbyspectrophotometry.

enzymemarkinstrument;3,5-dinitrosalicylicAcidColorimetry(DNS);Taraxacum kok-saghyzRodin;inulin

2016-04-01

朱金霞(1977-)，女，硕士，副研究员，主要从事植物资源与生物化学方面研究，E-mail:jinxiazhu001@163.com。

*通讯作者:张源沛(1968-)，男，博士，研究员，主要从事植物资源与生物化学方面研究，E-mail：zhangypei@163.com。

国家科技部国际合作项目 (2014DFR31020)；宁夏回族自治区科技支撑对外合作项目。

TS241

A

1002-0306(2016)19-0294-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.048