洗车河霉豆腐加工及优良毛霉菌种的筛选

丁宏武，彭彰文，彭珍珍，余兆硕，麻成金

（吉首大学食品科学研究所，湖南吉首 416000）

洗车河霉豆腐加工及优良毛霉菌种的筛选

丁宏武，彭彰文，彭珍珍，余兆硕，*麻成金

（吉首大学食品科学研究所，湖南吉首 416000）

从洗车河霉豆腐中进行毛霉菌种的筛选，得到3株优势菌株6，9，10号，其在28℃时生长茂盛且菌丝颜色呈白色，产蛋白酶活力高，并在霉豆腐后发酵期积累了一定的糖化酶和脂肪酶；在菌株培养72 h后菌体开始老化，酶活力开始下降。

霉豆腐；加工工艺；筛选；酶活力

0 引言

腐乳（Sufu）又称霉豆腐，是深受我国消费者喜爱的一种传统发酵豆制品。腐乳不仅含有大豆本身所有的多种生理活性物质，而且通过微生物发酵作用，将大豆的苦腥味、胀气因子、抗营养因子等不足之处全部克服，同时产生多种具有香味的有机酸、醇、酯、氨基酸，以及硫胺素、核黄素、尼克酸、钙和磷等营养成分[1]，并且不含胆固醇[2]。除此之外，腐乳含有的生理活性物质具有一定保健功能，发酵产生的核黄素含量比豆腐中含量高6～7倍[3]。

对于湖南来说，湘西龙山县洗车河霉豆腐当数一绝。2003年7月，中央12频道在《走玩湘西》节目中首次对其进行了特别报道。自此，味美、清香、可口、醇厚成为了洗车河霉豆腐的代名词。2007年11月，洗车河霉豆腐荣获中国湖南第九届（国际）农博会金奖，并已被列入湘西自治州非物质文化遗产保护项目。

但是，洗车河霉豆腐仍采用传统自然发酵的方式进行生产，不仅严重制约了其产业化发展，同时也存在着许多杂菌毒素感染的安全隐患。试验挑选了洗车河霉豆腐发酵毛坯上的毛霉菌株进行分离筛选，以期为大规模生产提供技术支持与品质保障。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

龙山洗车河霉豆腐发酵毛坯上分离得到的菌株。

1.2 培养基

（1）马铃薯蔗糖培养基[4]。去皮马铃薯20 g，蔗糖2 g，琼脂2 g，水100 mL，自然pH值，分装，于121℃下灭菌30 min，备用。

（2）麸皮培养基。称取麸皮90 g，水100 mL，自然pH值，适量装入250 mL三角瓶中，于121℃下灭菌30 min，及时摇散，备用。

（3）斜面种子培养基。酵母膏7 g，磷酸二氢钾1 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钙0.5 g，硫酸锌0.2 g，豆饼粉20 g，葡萄糖15 g，琼脂10 g，pH值6.0，用蒸馏水煮沸溶解后定容至1 000 mL，分装，于121℃下灭菌30 min，备用。

（4）酪蛋白（干酪素）琼脂培养基。酪素的母液质量分数为4%，是将4 g干酪素溶解于30～35 mL 的0.1 mol/L NaOH水溶液中，水浴溶解20 min，待溶解完全后加入60～70℃热水，稀释到所需质量分数（即定容到100 mL），即得到母液质量分数为4%的酪素溶液。培养条件为pH值6.5～7.0，121℃，灭菌30 min（腐乳中毛霉菌株的初步筛选及其培菌期的生化变化）。

1.3 试验仪器

101-2AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司产品；HZFB200型电子天平，美国康州HZ电子有限公司产品；E-201-C型pH计，上海精科实业有限公司产品；WSL-2型比色计，上海昕瑞仪器仪表有限公司产品；YXQ-SG46-280S型手提式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯公司产品；HH-S2型恒温水浴锅，金坛市成辉仪器厂产品；KDN型系列自动凯氏定氮仪，浙江托普仪器有限公司产品；SPX-250B型生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；VS-1300-U型超净工作台，上海乔跃电子有限公司产品。

1.4 工艺流程

新鲜豆腐→划块→豆腐坯→纯种霉菌接种→培养→搓毛→食用盐腌制→添加辅料后装坛→后熟→成品。

1.4.1 前发酵操作要点

（1） 切块。豆腐经滤水后，切块时要厚薄均匀、富有弹性，无气泡现象，一般切成2 cm见方的块状。

（2）接种培养。将切好块的豆腐以1～3 cm的间距摆放在笼格上，用喷雾器均匀地喷洒含有培养基培养的毛霉菌悬浮液，然后放置于发酵室内进行培养，温度控制在20～25℃。在接种24 h后应翻笼1次，调节上下温差，补给空气，使毛霉菌正常繁殖，以后间歇倒笼，以降低品温，直至制曲成熟。

（3）搓毛。培养结束，长满菌丝的毛坯要及时搓毛。搓毛是将长在豆腐坯表面的菌丝搓倒，使棉絮状菌丝将豆腐坯包住，有利于保持产品的外形；同时，将块与块之间的菌丝搓断，把连接的豆腐块分开。

1.4.2 后发酵工艺

（1）腌坯。腌坯时，要分层加盐，下层盐少一些，向上逐层增加。其作用为使盐分在豆腐中充分渗透，使菌丝与毛坯收缩，失水变硬，经后发酵不松散，呈味且防腐，使其缓慢水解，防止腐乳靡烂。

（2）加辅料装坛。添加香辛料、米酒、茶叶、食用油等辅料，装坛时不可装得过紧，否则发酵不完全，中间有夹心；也不能装歪，以免影响产品外观。

（3）封口。封口是最后一道工序，也是一个关键性工序。封口时，先选好合适的坛盖，再以盐水密封；要严防漏气，漏气使酒精蒸发，不仅易染杂菌，使腐乳发霉变质，还会使霉豆腐风味大打折扣。

1.5 测定方法

1.5.1 菌种的分离纯化

将长满毛霉菌丝的腐乳坯制成1×10-1～1×10-6的菌悬液，并从1×10-3～1×10-6的稀释液中取0.1 mL分别涂布到马铃薯蔗糖培养基上，且每个稀释度做3次平行试验，于28℃培养箱中恒温培养48 h，再选取生长速度快、菌丝丰满、表面颜色一致的毛霉单菌落，在选择培养基上划线分离，将透明圈最大的纯种毛霉蛋白酶菌株接种到马铃薯蔗糖培养基上，于28℃培养箱中培养48 h，待长满孢子后备用[5-6]。

1.5.2 菌种的活化

用接种环取分离出的毛霉菌株，接入新鲜的种子培养基中，置于28℃培养箱中培养48 h。

1.5.3 菌种的初筛

采用透明光圈法，将菌悬液点接入酪蛋白培养基中，于28℃培养箱中培养48 h后测定透明圈的直径与菌落直径的比值（Hc），以Hc值的大小比较蛋白酶活力的高低。

1.5.4 菌种的复筛

取0.5 mL菌悬液（孢子数为10个/mL），接入麸皮培养基中，摇匀后于28℃培养箱中培养48 h。取一定量的鲜曲，制备酸性、碱性及中性蛋白酶粗酶液后，测定其相应蛋白酶的活力。

1.5.5 蛋白酶粗酶液的制备

取上述培养基中物质放入锥形瓶中，加入100 mL无菌水，并捣碎培养物，同时分别加入20 mL的0.1 mol/L，pH值为2.6的乳酸-乳酸钠缓冲液及0.1 mol/L，pH值为7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液和0.05 mol/L，pH值为10.0的硼砂-氢氧化钠缓冲液，在40℃水浴中浸提1 h，间断搅拌，经滤纸过滤后即得到相应的酸性、中性和碱性蛋白酶粗酶液。

1.5.6 蛋白酶活力的测定

采用福林-酚法（SB/T 10317—1999），分别用相应的pH值（2.6，7.2，10.0） 缓冲液配置酪蛋白溶液作底物，测定酸性、中性及碱性蛋白酶活力的高低。定义在40℃条件下，每1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需酶量为1个酶活单位。

1.5.7 样品预处理

准确称取腐乳样品25 g，研磨后溶于200 mL蒸馏水中，煮沸几分钟且在此期间不停搅拌，冷却后定容至250 mL，静置6 h，每30 min振荡1次，最后用多层纱布过滤，得10%清液。

1.5.8 蛋白质的测定

采用凯氏定氮法（GB 50095—2010），测定样品可溶性蛋白质时，取定量的样品清液进行测定。

1.5.9 氨基酸态氮的测定

采用甲醛滴定法（SB/T 10170—2007）测定。

1.5.10 总酸的测定

采用总酸度测定法（SB/T 10170—2007）测定。

2 结果分析

2.1 毛霉菌株的筛选

2.1.1 菌株的初筛

将龙山洗车河霉豆腐毛坯上发酵的毛霉菌株接种到选择培养基上，于28℃下培养48 h，对目标毛霉进行多次分离纯化，然后进行初筛，选出10株左右合适的毛霉菌株。

将毛霉菌株培养后测定各个菌株的Hc值，然后根据Hc值的大小进行筛选，从中选出6株菌种，在此基础上再进行下一步讨论。

各菌株Hc值的比较见表1。

表1 各菌株Hc值的比较

由表1可知，1，2，3号的Hc值最低，4，7，9号的Hc值最高，其余的较一般。根据Hc值选择4，6，7，8，9，10号。

2.1.2 毛霉菌株的复筛

将上述所选的毛酶菌株于28℃下进行培养，定时观察其生长情况。包括菌丝的表面状态、菌落的高度、长势以及菌落的颜色，根据其生长情况来筛选出适合的毛霉菌种进行培育，并经扩大培养后放于4～6℃进行保存。

培养期毛霉菌株生长情况的比较见表2。

根据表2可得，4，8号生长速度缓慢菌丝低矮；而6，9，10号生长速度较快且菌丝较高、长势也好，菌落颜色都是呈纯白色；7号的生长情况一般。故选择6，9，10号作为优良菌种进行下一部分的出发菌种。

2.1.3 优势菌种小型生产试验

通过对照试验来验证所选出来的优势菌种效果，将优势菌种和原菌种各接种到腐乳毛坯上，于28℃下培养，观察并比较毛霉的生长情况，测定相应的酶活力。

原菌种与优势菌种在腐乳上的培养情况见表3。

2.1.4 优势菌种培养期生理变化

（1）优势菌株蛋白酶作用最适pH值比较。

表2 培养期毛霉菌株生长情况的比较

表3 原菌种与优势菌种在腐乳上的培养情况

优势菌种在酸性、中性和碱性条件下蛋白酶活力比较见图1。

图1 优势菌种在酸性、中性和碱性条件下蛋白酶活力比较

由图1可知，优势菌种均以产中性蛋白酶为主，蛋白酶作用最适pH值为9.0左右。

（2）优势菌株在培养期各酶活力比较。

图2 不同培养期6，9，10号蛋白酶活力

不同培养期6，9，10号蛋白酶活力见图2。

由图2可知，9号产蛋白酶能力较其他2个菌株高，且3个菌株在72 h产酶能力达到最高，随后随着培养时间的增加有所降低。

2.2 优势菌种培养期豆腐坯的主要变化

6 号菌株培养期豆腐坯变化见图3，9号菌株培养期豆腐坯变化见图4，10号菌株培养期豆腐坯变化见图5。

图3 6号菌株培养期豆腐坯变化

图4 9号菌株培养期豆腐坯变化

由图3～图5可知，在接种12 h左右后豆腐坯中的水溶性蛋白质含量、氨基酸态氮以及总酸随之增加，且在24 h左右酶活力达到高峰，但在48 h左右酶活力有所下降，水溶性蛋白质含量、氨基酸态氮含量以及总酸含量增长也随之减缓。

图5 10号菌株培养期豆腐坯变化

3 结论

从湖南龙山洗车河霉豆腐中分离得到的毛霉菌种，经筛选后得到3株优势菌株6，9，10号。6，9，10号生长速度快，菌丝高度可达12 mm，且长势茂密，颜色都呈纯白色，最后选择以上3个菌株作为优势菌种进行豆腐坯试验。

通过培养期的试验和豆腐坯试验的综合研究，优势菌株培养60 h左右在豆腐坯表面积累了大量的蛋白酶以及一定量的糖化酶和脂肪酶，在72 h后菌体开始出现老化现象，故其酶活力出现下降趋势。试验对洗车河霉豆腐中的优势菌种进行了较好的筛选，便于后续低盐优质霉豆腐的产品生产。

[1]刘亚，杨光影，吴悦，等.腐乳研究进展 [J].农产品加工（学刊），2013（12）：64-65.

[2]符晓静，孙君社.微生物蛋白酶在腐乳生产中的应用研究进展 [J].食品科学，2005，26（S1）：121-124.

[3]范俊峰，李里特，张艳艳，等.传统大豆发酵食品的生理功能 [J].食品科学，2005，26（1）：250-254.

[4]李璘佼，车振明，汪彬彬.腐乳中毛霉菌株的初步筛选及其培菌期的生化变化 [J].中国调味品，2010（9）：56-64.

[5]刘芳，曹新志，方春玉，等.腐乳毛霉蛋白酶菌株紫外线诱变育种 [J].生物技术，2009，19（5）：50-52.

[6]费国源，孙培龙.蛋白酶改性处理对小麦面筋蛋白溶解度和起泡性的影响 [J].农产品加工（学刊），2009（1）：32-34.

Processing Technology and Screening of Elite Strain for Sufu in Xichehe

DING Hongwu，PENG Zhangwen，PENG Zhenzhen，YU Zhaoshuo，*MA Chengjin （Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hu'nan 416000，China）

The experiment screenes three target strains from natural fermentation microorganism of Xichehe Sufu which are NO.6，NO.9 and NO.10.Under temperature of 28℃，the mycelia are prosperous with white color，producing high-active protease.The three strains accumulate a large number of saccharifying enzyme，lipase during cultivation，but after 72 hours，thalli become old with enzyme activity declining.

Sufu；processing technology；screening；enzymatic activity

TS214.2；TS201.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.038

1671-9646（2016）11b-0034-04

2016-09-08

吉首大学食品与生物类专业大学生创新训练中心资助项目（JDCX2015-13）。

丁宏武（1993—），男，在读本科，研究方向为食品资源加工与利用。

*通讯作者：麻成金（1963—），男，硕士，教授，研究方向为食品资源加工与利用。