山楂叶总黄酮对肥大心肌细胞线粒体功能的影响

徐颖，李劲松，孙涛

·药理毒理·

山楂叶总黄酮对肥大心肌细胞线粒体功能的影响

徐颖1，李劲松2，孙涛1

山楂叶总黄酮为山楂叶的主要活性物质群，国内外研究发现其药理作用集中于心脑血管方向，其作用机制主要为抗氧化应激损伤，保护细胞线粒体功能等。本文采用AngII致心肌细胞肥大模型，研究山楂叶总黄酮对肥大心肌细胞线粒体功能的影响，以期为山楂叶总黄酮治疗心衰的线粒体保护途径提供研究思路。

山楂叶；总黄酮；线粒体功能

山楂叶为蔷薇科山楂属植物山里红Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br.或山楂C.pinnatifida Bge.的叶，具有活血化瘀、理气通脉的功效。在我国，早在东晋《肘后方》中就有山楂叶“茎叶煮汁，洗漆疮”的记载，2010版《中国药典》正式收载山楂叶。

黄酮类化合物作为山楂叶的主要活性物质群，主要包括槲皮素、金丝桃苷、牡荆素、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷等，最新研究显示，山楂叶总黄酮（Hawthorn leaves flavonoids，HLF）药理作用主要集中于心血管方向，包括：调节脂质代谢、保护血管内皮、抗动脉粥样硬化、对心、脑、肾等器官组织缺血再灌注损伤病理程度的改善及保护等作用，其机制主要涉及清除氧自由基，降低血清总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）量，提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）/TC比值，改善细胞功能代谢，保护细胞线粒体功能，调节相关细胞因子及基因的表达等。

在慢性心衰的各种病理改变中，线粒体的结构与功能的改变处于中心地位。心脏通过能量代谢将储存于脂肪酸和葡萄糖中的化学能转化为机械能，为心脏的收缩和舒张等耗能过程提供能量。因此，本研究从心衰的线粒体功能途径入手，研究HLF对心衰细胞模型（AngII致心肌细胞肥大）线粒体功能的干预及影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

山楂叶总黄酮（HLF，Hawthorn leaves flavonoids，纯度＞90%）购于山西晋城中晋药业公司；缬沙坦（中国食品药品检定研究院）；II型胶原酶、Ang II、5-溴脱氧尿嘧啶、D-Hanks溶液（Sigma公司）；DMEM培养基、磷酸盐缓冲液、胎牛血清、胰蛋白酶、青-链霉素（Gibco公司）；细胞增殖试剂盒IIXTT（Roche公司）；96孔板、细胞培养瓶（Corning公司）；动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒、纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂盒、线粒体内膜功能/膜电位（JC-1）测定试剂盒、线粒体外膜功能检测试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司）。

1.2 仪器

电动移液器（Eppendorf公司）；电子天平（Sartorius公司）；超净工作台（上海博迅公司）；倒置荧光显微镜（Leica公司）；酶标仪、CΟ2培养箱（Thermo公司）；低温离心机（Beckman 公司）。

1.3 方法

1.3.1 心肌细胞分离、纯化、培养、鉴定 参考文献[1]并改进如下：1～3 d SD乳鼠，取出心脏，置于预冷的D-hanks溶液，眼科剪减去心脏的1/2，留心尖部心室组织；然后分别沿横、纵两个方向剪开剩余心室组织，放入0.1%的胰蛋白酶中，置于摇床上往复30 次/min速度，4℃冰箱震荡过夜。第2日加入胰蛋白酶等体积的培养液，37℃水浴箱以往复60 次/min的速度震荡10 min后终止消化，弃上清。加入浓度为0.08%Ⅱ型胶原酶，置37℃水浴箱以60 次/min的速度震荡10 min，收集上清，并用等体积的培养液中和收集到的上清液。此步骤重复3～5次，直至组织基本消化为止。收集各次消化的液体，1500 r．min-1离心5 min，弃上清，用DMEM培养液制成单细胞悬液。采用差速贴壁进行分离，收集细胞悬液，用含10%胎牛血清的DMEM稀释，同时，每10 mL细胞悬液中加入80 μL5-溴脱氧尿嘧啶以抑制非心肌细胞增殖，细胞计数，接种细胞，培养3天后使用。常规免疫组化方法进行鉴定，一抗选择大鼠α-横纹肌动蛋白单克隆抗体，SABC染色，DAB显色。

1.3.2 实验分组及给药 综合XTT细胞活力测定实验结果及前期预实验，实验分组及给药浓度设定如下，分别为：空白对照组（心肌细胞正常培养）；AngII组（1 μmol．L-1）、AngII（1 μmol．L-1）+缬沙坦（1 μmol．L-1）组、AngII（1 μmol．L-1）+HLF（200 μg．mL-1）组。

1.3.3 心肌细胞直径及总蛋白含量测定 心肌细胞常规培养3 d后，含1.5%血清培养基培养24 h，分组给药作用72 h，倒置荧光显微镜观察、拍照，图像分析软件测量心肌细胞直径，计算平均值；BCA法测定心肌细胞总蛋白含量。

1.3.4 心肌细胞线粒体内膜功能/膜电位测定 阳离子荧光羰花青染色剂JC-1是一种对膜电位高度敏感的染色剂。它能够特异性地进入线粒体，分布和结合在线粒体基质上。线粒体膜电位的高低变化决定了JC-1的分布浓度。电位高，JC-1形成聚集体，而浓度高，荧光显色为红色或桔红色；反之，则为绿色。心肌细胞细预处理方法及作用时间同1.3.3，严格按照心肌细胞线粒体内膜功能/膜电位检测试剂盒说明书进行后续步骤操作：使用倒置荧光显微镜观察红、绿荧光，荧光条件设定如下：观察红色荧光（滤波器激发波长490 nm、散发波长590 nm）；观察绿色荧光（滤波器激发波长490 nm、散发波长530 nm）；显微镜图像分析软件计算MMP（红色荧光与绿色荧光强度比值），若MMP降低则提示心肌细胞线粒体内膜功能损害。

1.3.5 心肌细胞线粒体膜外膜功能测定 细胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase，CΟX）存在于真核生物的细胞线粒体上，主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。作为线粒体外膜功能的生物标记，通过测定在去垢剂（既使CΟX酶保持活性，又使外膜充分裂解）存在与否的条件下，线粒体的酶含量变化，来衡量线粒体外膜的完整性。心肌细胞细预处理方法及作用时间同1.3.3，严格按照高质纯化线粒体分离试剂盒及线粒体外膜功能检测试剂盒说明书进行后续步骤操作：计算线粒体膜外损伤率（稀释液处理的心肌细胞线粒体样品为损伤线粒体释放的CΟX活性，裂解液处理的为总CΟX活性，前者与后者的比值即为线粒体外膜损伤率）。

1.3.6 数据分析 实验重复3次，数据用 ±s代表，采用spss15统计软件进行单因素方差分析，P ＜0.05 表示有显著性意义。

2 结果

2.1 心肌细胞总蛋白含量测定

与空白对照组相比，AngII组能显著增加心肌细胞总蛋白含量；与AngII比较，AngII+缬沙坦组、AngII+HLF能够显著降低异常升高的总蛋白含量，结果详见表1。

表1 心肌细胞总蛋白含量测定（±s）

表1 心肌细胞总蛋白含量测定（±s）

组别 剂量 n 总蛋白含量(mg/106 cell)空白对照 — 3 0.688 ±0.082

注：与空白对照组比，**P＜0.01；与AngII组比较，△△P＜0.01

2.2 心肌细胞直径测定

与空白对照组相比，AngII组能显著增加心肌细胞直径；与AngII比较，AngII+缬沙坦组、AngII+HLF能够显著降低异常升高的心肌细胞直径，结果详见表2。

表2 心肌细胞直径测定（±s）

表2 心肌细胞直径测定（±s）

注：与空白对照组比，**P＜0.01；与AngⅠⅠ组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 剂量 n 细胞直径（μm）空白对照 — 3 18.370±1.439 AngII 1 μmol．L-13 25.073±2.040** AngII+缬沙坦 1 μmol．L-1+1 μmol．L-13 21.317±1.888△△AngII+HLF 1 μmol．L-1+200 μg．mL-13 22.338±2.611△

2.3 心肌细胞线粒体内膜功能/膜电位测定

与空白对照组相比，AngII组能显著降低MMP；与AngII比较，AngII+缬沙坦组、AngII+HLF能够显著升高异常降低的MMP，结果详见表3。

表3 心肌细胞粒体内膜功能/膜电位测定（±s）

表3 心肌细胞粒体内膜功能/膜电位测定（±s）

注：与空白对照组比，**P＜0.01；与AngII组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 剂量 nMMP(红/绿荧光强度)空白对照 — 3 2.900±0.639 AngII 1 μmol．L-13 1.167±0.162** AngII+缬沙坦 1 μmol．L-1+1 μmol．L-13 2.186±0.163△△AngII+HLF 1 μmol．L-1+200 μg．mL-13 1.650±0.297△

2.4 心肌细胞线粒体外膜功能测定

与空白对照组相比，AngII组能显著升高外膜损伤率；与AngII比较，AngII+缬沙坦组、AngII+HLF能够显著降低异常升高的外膜损伤率，结果详见表4。

表4 心肌细胞线粒体外膜功能测定（±s）

表4 心肌细胞线粒体外膜功能测定（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与AngII组比较，△△P＜0.01

组别 剂量 n外膜损伤率（%）空白对照 — 3 3.997±0.730 AngII 1μmol．L-13 12.377±1.494** AngII+缬沙坦 1μmol．L-1+1μmol．L-13 8.453±1.021△△AngII+HLF 1μmol．L-1+200μmol．L-13 10.042±1.305△△

3 讨论

黄酮作为一种天然的抗氧化剂，对于很多细胞都能发挥抗氧化应激损伤作用。山楂叶中富含黄酮，其黄酮含量超过山楂的其它有效部位。通过色谱法研究发现，HLF中含有槲皮素、牡荆黄素，pinnatifidaC、pinnatifidaD等[2～4]。

目前，国内以山楂叶总黄酮为主的制剂益心酮片、胶囊等近年来在临床上被用于高血压、高血脂、冠心病等疾病的治疗。欧洲的最新研究结果显示[5]，欧洲属山楂叶提取物WS1442（从山楂叶中提取出来的一种天然的抗氧化剂，主要成分为黄酮和聚合黄烷类，在一部分欧洲国家，已被批准用于治疗早期的充血性心衰）可安全延长已接受过药物治疗的充血性心衰患者的生命，欧洲的156个研究中心共同实施了随机双盲临床实验—SPICE研究。该研究中84%的受试者是男性，44%的患者心功能受损严重，前18个月的研究显示，WS1442组的患者心源性死亡率减少20%，寿命延长了4个月。

在慢性心衰的各种病理改变中，线粒体的结构与功能的改变处于中心地位。心脏通过能量代谢将储存于脂肪酸和葡萄糖中的化学能转化为机械能，为心脏的收缩和舒张等耗能过程提供能量。

因此，本研究从心衰的线粒体功能途径入手，研究HLF对心衰细胞模型（AngII致心肌细胞肥大）线粒体功能的干预及影响，结果显示：山楂叶总黄酮200μg．mL浓度组，能显著降低AngII所致异常升高的总蛋白含量、心肌细胞直径、线粒体外膜损伤率；显著升高AngII所致异常降低的MMP。故推测山楂叶总黄酮是通过干预及影响肥大心肌细胞线粒体功能来发挥心肌细胞保护作用。

[1] 陶静,马依彤,李晓梅.原代乳鼠心肌细胞培养方法的改进[J].中华心血管病杂志,2014,42(01):53.

[2] PC, Z. and X. SX, Flavonoid Ketohexose furanosides from the leaves of Crataegus pinnatifida Bge[J] . Var. majo r N. E. B r.Phytochemistry, 2001,57(8): 1249.

[3] Rice-Evans, C.A., et al. The relative antioxidant activities of plant-derived polyphenolic flavonoids[J]. Free Radic Res, 1995.22(4):375.

[4] Castelluccio, C., et al. Antioxidant potential of intermediates in phenylpropanoid metabolism in higher plants[J]. FEBS Letters, 1995. 368(1): 188.

[5] Vanden Hoek, T.L., et al. Significant Levels of Οxidants are Generated by Isolated Cardiomyocytes During Ischemia Prior to Reperfusion[J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 1997. 29(9): 2571.

（责任编辑：陈思敏）

The study of the effect of Hawthorn leaves flavonoids on the mitochondrial function of hypertrophic cardiomyocytes/

XU Ying1, LI Jing-song2, SUN Tao1//(1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan; 2. The first People's Hospital of Guangyuan, Guangyuan 628017, Sichuan)

The flavonoids are the main active substance groups of Hawthorn leaves. Recent study showed that the pharmacological research of Hawthorn leaves flavonoids are focused on heart and cerebral vessels. Main mechanism involved are anti-oxidative stress damage and protection of the function of mitochondria of cells. AngII-induced cardiomyocyte hypertrophy model are used to study the effect of Hawthorn leaves flavonoids on the mitochondrial function of hypertrophic cardiomyocytes, and to provide research ideas for the mitochondrial protection of Hawthorn leaves flavonoids in treatment of heart failure.

Hawthorn leaves; flavonoids; mitochondrial function

R 285.5

A

1674-926X(2016)04-011-03

四川省科技厅应用基础研究计划项目(编号: 2013JY0068)；四川省中医药管理局中药基础研究项目(编号:2014F013)；广元市科技局科技支撑计划项目(编号:14KJZCS003)；成都中医药大学科技发展基金(编号:030029041)；成都中医药大学科技发展基金(编号:030029053)

1.成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137；

2. 广元市第一人民医院，四川 广元 628017

徐颖，讲师，主要从事中药药理研究

Email:497412855@qq.com

孙涛，副教授，主要从事中药药理研究

Email:suntao2178@126.com

2016-06-23