表皮葡萄球菌生物膜形成的基因调控及中药对其抑制作用的研究进展

祖瑞铃，李燕

·综述进展·

表皮葡萄球菌生物膜形成的基因调控及中药对其抑制作用的研究进展

祖瑞铃，李燕

表皮葡萄球菌已成为目前生物材料相关感染的重要病原体，生物膜形成是其主要致病及耐药因素。生物膜的形成主要有3个阶段：黏附、聚集、成熟，每个阶段都由不同的因子进行调控，且机制复杂。由于生物膜的产生导致表皮葡萄球菌对多种抗生素产生耐药，因此，中药抑制表皮葡萄球菌生物膜的相关研究逐年增多。本文就近年来表皮葡萄球菌生物膜形成基因调控及中药抑制其作用的相关研究进展作一综述。

表皮葡萄球菌；生物膜；中药；基因调控

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，SE）是一种常见的定殖在人体皮肤上的凝固酶阴性葡萄球菌，但随着高分子材料制成的医疗植入物（导管、人工心瓣膜、人工关节等）广泛应用，SE引起的生物材料相关性感染已逐年上升，生物膜形成是其重要的原因。生物膜（biofilm,BF）是一群粘性的，表面附着的细菌群，这些细菌嵌入在细胞外基质，产生一系列分子，包括许多蛋白质和胞外聚合物，例如胞间多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA），抑制吞噬和免疫分子的活性，以躲避宿主防御[1]。

1 BF的形成及相关基因的调控

1.1 BF的形成

细菌BF的形成主要有3个阶段，第一阶段是黏附，早期细菌黏附于生物材料表面主要通过两者之间存在的理化作用力，后期细菌通过细胞外基质的某些成分和生物蛋白组分进一步粘附，这一过程需要受体与配体的相互识别与结合，因而具有选择性和特异性。第二步是聚集，菌体附着于介质表面后，就进入BF的发展阶段，在PIA等因子的介导下，细菌之间相互聚集，继而分化、增殖，形成多层的微菌落，同时分泌大量的黏液样物质将之包裹其中形成BF，随后众多微菌落的形成进而连接成大的扩散性结构的过程。研究发现在菌体生长增殖的同时，其分泌的胞外多糖(expolysaccharide，EPS)显著增加。EPS可黏结细菌而形成微菌落，大量微菌落使BF加厚。当微菌落扩大到一定程度，BF就进入了成熟阶段。在此阶段中，细菌通过密度感应系统监测其群体的细胞密度，从而调节多种靶基因表达，以保证BF中营养物质的运输和废物的排出，避免细菌过度生长而造成空间和营养物质的缺乏。

1.2 BF形成的基因调控

BF形成的过程十分复杂，涉及到众多的基因参与调控（见图1），就目前的研究成果来看，其中起重要作用且研究较多的有PIA的调控基因及密度感应系统(quorum-sensing system,QS)。

图1 BF基因调控示意图[2]

1.2.1 PIA及其相关基因 PIA，也称聚N-乙酰葡糖胺( PNAG)，缺乏 PIA 的表皮葡萄球菌初期黏附到生物材料上的能力正常，而后期细胞间相互黏附能力却大大下降，无法形成BF，说明PIA在细菌间的粘附过程中起重要作用。PIA是一种粘多糖，是表皮葡萄球菌细胞外基质材料的主要成分，大多数PIA的结构为β-1,6 连接 2-脱氧-2-氨基-D-吡喃型葡萄糖残基，其中 80%-85%的单糖 N 端乙酰化[3]。PIA 由 4 个开放阅读框icaA，icaD，icaB，icaC组成的icaADBC操纵子编码。4种基因在结构上依次排列，其转录产物分别为IcaA，IcaD，IcaB，IcaC 4种蛋白。icaR基因位于icaA的上游，其产物为IcaR，是DNA结合蛋白，与icaA的5'端转录起始点结合而抑制icaADBC操纵子的转录形成，从而抑制BF的形成[4]。

随着对BF基础研究的深入，新发现的某些基因如sarA基因、arlRS、IS256插入序列等也可以调控ica操纵子的表达[5]。sar即葡萄球菌附属调节因子(staphylococcal accessory regulator，sar)，它可以编码一种DNA结合蛋白--SarA蛋白，SarA可通过激活agr调控系统中P2和P3启动子区域，增加RNAIII的转录水平，也可独立于agr系统发挥作用。SarA还可以通过控制sepA的转录来调节自溶性的eDNA释放，从而操控SE的BF形成。此外，sarA可促进icaADBC转录，因此SE可以使用sarA通过不同途径参与细菌间的聚集和BF的积累[6]。Yang Wu等[7]通过建立ArlRS缺陷株，发现ArlRS缺陷株不能形成像野生株那样形成紧密坚实的BF，并且通过实时荧光PCR检测ArlRS缺陷株的ica，rsbU，sigB和sarA的表达都受到了抑制，认为arlRS可能通过依赖ica调节SE的BF形成。

1.2.2 QS系统 SE的QS系统主要有agr和luxS两种。附属基因调节子(Accessory gene regulator，agr )具有上调吸附和下调细菌分离的分子作用机制[8]，促进SE分泌毒素，降低细胞表面蛋白，以此来调控SE的致病力和BF的形成。agrA可以直接调节psmα和psmβ基因产生PSM( Phenol-soluble modulin)，PSM是一种具有两性亲和性的短肽。Rong Wang等[9]认为PSM与BF形成相关，他们发现中等浓度的βPSM可以通过对通道的破坏促进BF的成熟，而高浓度的βPSM导致BF的剥离从而抑制了BF的发展。也有研究发现，agr可以通过调控其他基因的表达来调节BF的形成。agr可以通过调节atlE的表达来影响AtlE的产生，AtlE是由atlE编码的与直接粘附有关的重要的一种自溶素(autolysin)，是一种葡萄球菌细胞壁溶解酶，位于细菌细胞表面。在agr缺失的菌株中，atlE表达增加，细菌的初始粘附作用增强[10]。另外，agr系统还可以负调控SE的clpP基因表达，缺少clpP基因可以抑制SE对高分子材料的粘附能力，缺少clpP基因也抑制了PIA的生成。因此，agr对clpP基因表达的抑制作用可能是它负调控SE粘附能力的机制之一。

最近发现SE中luxS系统可下调PIA的生成。SE中的luxS决定了AI-2的产生，实验证明luxS基因可以通过由AI-2介导的细胞信号机制来抑制SEBF的形成。并且luxS可以在转录水平上对ica基因的表达进行负性调节。因此luxS依赖的QS系统可以调节PIA的表达，从而调节BF的形成。此外，AI-2信号对PSM 的产生也有着重要影响，luxS系统可能还可以通过对PSM 的调控来影响BF的成熟和细菌的脱落。

1.2.3 其他调节BF形成的相关分子 SE的粘附过程可以分为直接粘附和间接粘附，除了AtlE，还有另一种与直接粘附相关的自溶素Aae，也具有溶菌活性和粘附作用，SSP(葡萄球菌表面蛋白)也参与了直接粘附过程，它们分别由aae和ssp基因编码。目前对参与间接粘附的细菌表面蛋白研究较多的是纤维蛋白原结合蛋白(fibrinogen-binding protein, Fbe)，编码细胞壁表面蛋白Fbe。近来有人发现SE表面的SdrG蛋白可以促进SE粘附上有纤维蛋白原（fibrinogen,Fg）粘附的生物材料上，因此SdrG蛋白与细菌的粘附也有一定关系[11]。粘附一旦成功，细菌就开始大量增殖，在生物材料表面聚集成多层细胞，形成BF。这个过程需要诸多因子的共同作用，其中较重要的有PIA、AAP等。AAP是一种聚集相关蛋白(accumulationassociated protein)，可以在SE的细胞表面形成一种聚合的纤维，同时也可以调节细胞间的粘附[12]。Rahel Decker等[13]发现Sbp（Small basic protein）对SE在非生物表面定植有重要作用，Sbp可以影响多糖胞间粘附，促进PIA和积累相关蛋白（AAP）介导的细胞间聚集。

2 中药及有效成分抑制BF的相关研究

由于BF的产生导致SE对多种抗生素产生耐药，于是很多学者试图从中药入手找到可以抑制或破坏BF的药物。大量的体外实验已明确，很多种中药对于SE及其产生的BF有抑制作用。下文将介绍一些中药抑制SE的BF形成的作用机制。

2.1 盐酸小檗碱

黄连中主要有效成分为小檗碱，别名为黄连素、盐酸小檗碱，含量可达10%左右。盐酸小檗碱(berberine)，属于季胺碱，是生物碱中的一种，具有抗病原微生物、抗腹泻、抗炎等药理作用。何敏[14]等人通过荧光定量PCR检测SE的ica和agr基因的表达，发现经盐酸小檗碱处理的细菌ica和agr的表达均受到抑制，因此盐酸小檗碱可能通过抑制ica和agr的表达来抑制BF的形成。而廖璞等[15]试图从蛋白方面找到盐酸小檗碱作用SE的BF的机制，他们发现虽然经盐酸小檗碱处理以后BF形成关键基因icaA和agr的表达显著下降，但通过二维电泳进行蛋白质筛选并获得的差异表达蛋白质分子中，并未找到agr和icaA基因编码的蛋白质分子，可能它们在翻译过程中受到修饰，或在提取过程中对周围环境过于敏感而提前降解。然后他们进一步发现盐酸小檗碱可以有效抑制SE的BF形成，并减少BF形成关键物质PIA的产生，同时可抑制BF阳性的SE生长。他们通过双向电泳得到了23个表达差异的蛋白分子，其中有细菌生存代谢相关蛋白，如PIA，Lig，SsuB；有细菌蛋白合成和降解相关蛋白，如RplE、RpsB、L-LDH等；转录调节相关蛋白，如RPΟ7；还有一些蛋白参与了细菌骨架形成和蛋白磷酸化去磷酸化，以及DNA末端修饰和细菌反应的生化机制，这些都可能参与调节了细菌的生长繁殖，以及其BF的形成。这些蛋白质中以细菌能量代谢和蛋白合成相关的差异蛋白分子占多数，提示盐酸小檗碱可能是通过调控细菌代谢和关键蛋白的合成来阻止细菌增殖和BF的形成[16]。

2.2 蜂胶

蜂胶具有抗菌、消炎、抗氧化、增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种功能。蜂胶的成分极其复杂，类黄酮和萜烯类化合物是其主要活性成份[17]。朱明等人[18]建立葡萄球菌BF模型，并在形成成熟BF后加入不同浓度的新疆黑蜂胶提取物，发现随着蜂胶浓度增加其抑菌活性也增加，并且达到一定浓度后BF内的活菌数量明显减少，但是却不能完全清除BF内的细菌。姜游帅等[19]发现蜂胶在低浓度时的抑菌能力较弱，但是亚抑菌浓度却可以抑制多种毒力因素的产生，比如α-溶血素和BF，通过荧光定量 PCR技术检测到和空白对照相比1/2 MIC，1/4 MIC，1/8 MIC蜂胶作用后agrA，mRNA的相对表达量分别是对照组的22%，29%和38%，由此可见蜂胶对agrA转录的抑制作用。因此蜂胶可能通过抑制agr系统来抑制或破坏BF的形成。

2.3 茅苍术

苍术在临床上用于治疗脘腹胀满，食欲不振，泄泻，水肿，风寒感冒等症状。茅苍术根茎含挥发油约5%-9%，油的主要成分为苍术醇，苍术醇为β-桉叶醇和茅苍术醇的混合物，二者的含量比约6:4。另含其他多种有机及无机元素等[20]。钱静漪[21]等发现茅苍术挥发油对金黄色葡萄球菌的抑制作用具有浓度依赖性，茅苍术挥发油也可抑制细菌的粘附阶段，但是却与浓度不相关，在1/4MIC时，抑制作用最强。而通过检测agrA表达量的变化，也发现与药物浓度无明显线性关系，但是仍可以抑制agrA基因的转录。因此茅苍术挥发油可能是通过抑制agrA转录，使agrA表达下调，导致agr启动子P2、P3的转录下降，从而抑制下游基因的转录，最终导致一些毒力因子的表达下调，也影响BF的形成。而金黄色葡萄球菌的agr与SE的agr操纵子具有很高的同源性，茅苍术或许也可以通过对agr的抑制作用从而抑制SEBF的生成，但其具体作用机制暂不明确，还需我们进一步探索。

2.4 其他中药

桃柁酚从新西兰桃柁罗汉松中提取出来的天然活性产品，富含芳香二萜，具有良好的抗菌活性，能抑制包括葡萄球菌在内的多种革兰阳性菌的生长[22]。王晓红[23]等实验发现在亚抑菌浓度的桃柁酚作用于葡萄球菌后，与对照组相比，随药物浓度增加，icaA基因的表达受到抑制，PIA也以相同趋势受到抑制，agrA基因的表达也逐渐受到抑制；sarA基因的表达先被诱导后被抑制。由于sarA可通过激活agr调控系统发挥效应，也可独立于agr系统发挥作用，因此，桃柁酚可能通过影响sarA的转录，进而调控agr系统，最终调控ica操纵子操纵子的表达；也可能是通过抑制sarA的转录，直接作用于ica操纵子，进而影响细胞自溶作用和PIA形成，影响BF形成。另外，还有鱼腥草素钠可以通过作用于胞外聚合物质(Extracellular polymeric substances，EPS)抑制SEBF的形成[24]，裴金乐等[25]也发现金银花对SE生成的初期粘附阶段有抑制作用，并且可以有效清除成熟BF，官妍等[26]发现连翘苷虽对SE的BF初始黏附阶段无抑制作用，但对BF内细菌的代谢和BF形态均有显著影响，姜大娥等[27]也发现中药土槿皮的有效成分土槿乙酸，虽不能直接杀灭葡萄球菌，但对其BF形成有抑制作用。除此之外还有五倍子，黄岑等都对SE有显著抑制作用。

3 小结与展望

BF的形成是由多因子调控，而这些因子又受到基因的编码及调控，且各基因并不只是独立地调控其编码，而是多机制、多通路地调节多个因子，从而使细菌适应外界环境产生BF。研究BF的形成机制，找到阻断其表达的药物或方法，将为临床治疗提供更好的解决方案。由于BF的产生使SE对多种抗生素耐药，目前已有很多针对葡萄球菌的BF中药研究，试图找到可以抑制BF作用的有效药物，但中药的研究大多停留在初步阶段，尚未阐明其作用机制。不可否认的是中药针对BF有着自己独特的疗效，以后的研究也可针对中药对BF形成过程中关键基因的阻断作用来探讨其药用价值，并为治疗开辟另一条道路。

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Progress on the gene regulation of biofilm formation and inhibitory effect of Chinese medicine against biofilm of staphylococcus epidermidis/

ZU Rui-ling,LI Yan//(College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Staphylococcus epidermidis has become an important pathogen in the current biological material related infections. Biofilm turns into the main pathogenic factor, which enables the bacteria to resist multiple antibiotics.There are three phases of the biofilm formation: attachment of bacteria, accumulation and multiplication of bacteria, and maturation of biofilm.Every phase is regulated by many factors with complicated mechanism. Resistant to multiple antibiotics of staphylococcus epidermidis is caused by biofilm production.Therefore, the interests in studying traditional Chinese herbs suppressing and destructing the biofilm are increasing.The gene regulation of biofilm formation and inhibition of some herbs on staphylococcus epidermidisbiofilm formation are reviewed in the paper.

Staphylococcus epidermidis; biofilm; Chinese herbal; gene regulation

R 966

A

1674-926X(2016)03-017-04

四川省科技厅应用基础项目（2015JY0159）

成都中医药大学医学技术学院，四川 成都 611137

祖瑞铃，在读硕士研究生，主要从事细菌耐药分子机制研究

Tel:18502828171 Email:1217202695@qq.com

李燕，教授，主要从事细菌耐药的分子机制研究

Tel:15828231203 Email:1067267085@qq.com

2015-07-18