透骨散的质量标准研究

张晨，王长生，李春雪，董红娇，瞿燕

·炮制制剂·

透骨散的质量标准研究

张晨1，王长生2，李春雪1，董红娇2，瞿燕1

目的：建立透骨散的质量标准。方法：采用TLC法对透骨散中黄柏、芫花、大黄、没药进行定性鉴别；采用显微鉴别方法对透骨散中黄柏、芫花、大黄、白芷、红大戟、紫花地丁进行了鉴别；采用HPLC测定透骨散中盐酸小檗碱的含量，色谱柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 流动相甲醇-2.2%醋酸水（40:60），柱温25 ℃，检测波长265 nm。结果：定性鉴别中检出黄柏、芫花、大黄、白芷、没药，分离度好、专属性强且阴性无干扰。盐酸小檗碱线性范围为0.0875～1.4 μg（R2=0.9999），平均加样回收率 99.57%（RSD 0.55%）。结论：建立的质量控制方法操作简单、重复性好，可较好的控制透骨散的质量，为该制剂的工业化生产提供参考。

透骨散；质量标准；盐酸小檗碱；

透骨散为临床使用20多年的有效经验方，该方由黄柏、芫花、白芷、大黄、没药等八味中药组成。临床上用于骨髓炎，结核，冷脓肿等，疗效确切且经济实用。为控制临床用药的质量标准，保证其安全性和有效性，本研究对该制剂中黄柏、芫花、大黄、没药进行了薄层色谱鉴别，增加了显微鉴别研究，同时采用高效液相色谱法测定了方中有效成分盐酸小檗碱含量，为有效地控制该制剂的质量提供实验依据。

1 材料

Waters 2695型高效液相色谱仪（2996 PDA 检测器，Empower 化学工作站，美国），KQ5200E型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），METILER AE240S 型电子天平（梅特勒-托利上海有限公司），Leica DM 2000 生物显微镜（Leica Microsystems CMS GmbH）。透骨散（由成都中医药大学制剂教研室提供，批号20140407，20140102，20140530），盐酸小檗碱（成都普菲德生物技术有限公司，批号121128），黄柏、芫花、大黄、胶质没药对照药材及大黄酸、大黄素（中国药品生物制品鉴定所，批号分别为121510-201105，121062-200602，120984-201202，121250-201104，110757-200206，110756-200110）。甲醇为色谱（ΟCEANPAK），水为乐百氏纯净水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 黄柏[1]取透骨散10 g，加1%醋酸甲醇溶液40 mL，于60 ℃超声处理20 min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺黄柏阴性制剂，同法制成阴性对照溶液。另取黄柏对照药材0.2 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（2010年版《中国药典》一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液5～6 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30:15:4)的下层溶液为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。见图1。

2.1.2 芫花 取透骨散10 g，加石油醚（30～60℃）20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺芫花阴性制剂，同法制成阴性对照溶液。另取芫花对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（2010年版《中国药典》一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液5～6 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯(10:1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。见图2。

图2 芫花TLC鉴别图

2.1.3 大黄[2]取透骨散10 g，加甲醇20 mL，冷浸1 h，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇10 mL使溶解，再加盐酸1 mL，加热回流30 min，立即冷却，溶液用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚层，挥干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺大黄阴性制剂，同法制成阴性对照溶液。另取大黄对照药材0.3 g，加甲醇10 mL，同法制成对照药材溶液。再取大黄素及大黄酸对照品，分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2010年版《中国药典》一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述四种溶液5～6 µL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(302 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，置氨蒸汽中熏后，斑点变为红色，且阴性无干扰。见图3。

图3 大黄TLC鉴别图

2.1.4 没药[3]取透骨散30 g，加10倍量的水，照挥发油测定法(2010年版《中国药典》一部附录X D乙法）加环己烷2 mL，缓缓加热至沸，并保持微沸约2.5 h，放冷，取环己烷层作为供试品溶液。取缺没药阴性制剂，同法制成阴性对照溶液。另取胶质没药对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（2010年版《中国药典》一部附录Ⅵ B）试验。吸取上述三种溶液各5～6 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙醚（4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显现同颜色的斑点，且阴性无干扰。见图4。

图4 没药TLC鉴别图

2.2 显微鉴别[4]

本品为黄色粉末，置显微镜下观察[5]，纤维鲜黄色，直径16～38 μm，常成束，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维（黄柏）。油管多已破碎，含淡黄棕色分泌物（白芷）。花粉粒黄色，类球形，直径23～45 μm，表面有较明显的网状雕纹，萌发孔多数，散在（芫花）。草酸钙针晶束散在或存于粘液细胞中（红大戟）。草酸钙簇晶较大，直径20～160 μm，有的至190 μm（大黄）。非腺毛，长32～240 μm，直径24～32 μm，具角质短线纹（紫花地丁），结果见图5。

图 5 透骨散显微特征图（10×40）

2.3 盐酸小檗碱的含量测定[5]

2.3.1 色谱条件 色谱柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相甲醇-2.2%醋酸水（40:60）流速1 mL．min-1，柱温25 ℃，检测波长265 nm，进样量10 µL，见图6。

图6 透骨散HPLC图

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱（C20H17NΟ4·HCl）对照品适量，置于量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.14 mg的对照品溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取滤液0.5 mL，置量瓶中，精密加入甲醇14.5 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 阴性溶液的制备 按处方比例称取药材，根据透骨散制备方法制成缺黄柏的阴性对照样品，按照“2.3.3”项下方法制成缺黄柏阴性溶液。

2.3.5 线性关系考察 精密量取对照品溶液适量，用甲醇稀释，得到不同质量浓度的盐酸小檗碱对照品溶液，分别吸取各溶液10 μL，按“2.3.1”项下色谱条件测定。以进样浓度（mg．mL-1）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到盐酸小檗碱回归方程y=2E+07x-21788（R2=0.999 9），线性范围0.0875～1.4 μg。

2.3.6 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液10 μL，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样5次，结果盐酸小檗碱峰面积 RSD为0.73%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.3.1”项下色谱条件进样，结果盐酸小檗碱峰面积RSD为0.86%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.8 重复性试验 取透骨散（批号20140407）6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件测定，测得制剂中盐酸小檗碱平均含量为15.94 mg．g-1（RSD为0.71%），表明该方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 取已知含量的透骨散（批号20140407）6份，分别加入盐酸小檗碱对照品适量，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件测定，结果见表1，表明该方法回收率良好。

表1 透骨散中盐酸小檗碱含量测定的加样回收试验

2.3.10 样品测定 取透骨散3批，2份/批，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

课题组除了对透骨散中黄柏、芫花、大黄、没药进行薄层鉴别之外，还对方中剩余药材红大戟、紫花地丁、白芷、乳香进行了薄层鉴别研究，通过改变供试品的制备方法、采用不同的展开系统、显色剂和检视条件，但效果都不理想，因此后者的薄层鉴别暂不作为该制剂的质控方法；为更全面的对制剂进行定性鉴别，本研究增加了黄柏、芫花、大黄、白芷、红大戟、紫花地丁的显微定性鉴别。

色谱条件曾考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-水、甲醇-2.2%醋酸水等流动相体系，最终确立了最优的流动相体系为甲醇-2.2%醋酸水（40:60），柱温25 ℃，检测波长265 nm。

根据透骨散工艺研究结果，从3个批次样品中盐酸小檗碱的含量测定结果可见，盐酸小檗碱均能很好检出，各批次间样品含量介于14.6-18.7 mg．g-1。考虑使用的药材批间差异等因素，每1 mg样品中盐酸小檗碱含量限度计算如下：样品中盐酸小檗碱含量限度=黄柏药材处方量（g）×黄柏药材含盐酸小檗碱限度×盐酸小檗碱提取率限度/制备量（g）=90 g×3.0%×90% /690 g≈3.52 mg．g-1，故暂定本品每1 g含黄柏以盐酸小檗碱（C20H17NΟ4·HCl）计不得少于3.52 mg。

[1] 丁兆朋,郝智慧,杨芬芳,等. 黄白止痢颗粒质量标准[J]. 中国实验方剂学杂志,2013,19(17):117-120.

[2] 王贤儿,钟希文,张文霞,等. 蛇黄散质量标准[J]. 中成药,2014, 36(9):1867-1872.

[3] 国家药典委员会. 中华人民共和国:2010年版一部[S]. 北京:中国医药科技出版社,2010:22.

[4] 李萍,钱忠直主编. 中华人民共和国药典中药材显微鉴别彩色图鉴[M]. 北京:人民卫生出版社,2009.01.

[5] 唐艳梅,叶萌,向丽,等. HPLC测定黄柏中的盐酸小檗碱、盐酸巴马丁和盐酸药根碱[J]. 华西药学杂志,2006,21(3):265-267.

（责任编辑：傅舒）

Study on the quality standard of Tougu Powder/

ZHANG Chen1, WANG Chang-sheng2, LI Chun-xue1, DONG Hong-jiao2, QU Yan1/ / (1.School of Pharmacy , Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan; 2.College of Chemistry &Environment Protection Engineering, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041,China)

Objective: To establish the quality standard of Tougu Powder. Method: Huangbo, Yuanhua, Dahuang and Moyao in Tougu Power were identified qualitatively by TLC. Microscopic identification of Huangbo, Yuanhua, Dahuang, Baizhi, Hongdaji, and Zihuadiding in Tougu Powder was carried out. Berberine hydrochloride content in Tougu Powder was determined by HPLC. The analysis was carried on a Diamonsil C18(250 mm ×4.6 mm, 5μm) column. The mobile phase was composed of methanol and 2.2% acetic acid water (40:60). The column temperature was 25℃ and detection wavelength was set at 265 nm. Result:Huangbo, Yuanhua, Dahuang, Baizhi and Moyao were detected by qualitative identification, which had good separation, strong specificity and had no negative interference. The linear range ofberberine hydrochloride was 0.0875～1.4 μg（R2=0.9999）with the average recoveries of 99.57% (RSD 0.55%). Conclusion: The method is simple, rapid and accurate, which can be used as Tougu Powder's quality control method.

Tougu Powder; quality standard; berberine hydrochloride

R283.3

A

1674-926X(2016)04-008-04

“十二五”科技部支撑计划（2012BAI27B07），四川省科技厅科技基础项目（2015JY0139）

1. 成都中医药大学，四川 成都 611137；2.西南民族大学化学与环境保护工程学院，四川 成都 610041

张 晨，在读硕士，从事中药炮制与制剂研究

Tel:18782916423 Email:m18782916423@163.com

瞿燕，博士，副教授，从事中药炮制与制剂研究工作

Tel:028-61800231 Email:quyan028@126.com

2015-09-10