灯盏细辛与赤芍配伍对永久性脑缺血损伤大鼠的保护作用

范娅丹， 韩江全， 邓才洪



灯盏细辛与赤芍配伍对永久性脑缺血损伤大鼠的保护作用

范娅丹， 韩江全， 邓才洪

目的 探讨灯盏细辛与赤芍配伍药对脑缺血性损伤大鼠的保护作用及可能机制。方法 方法48只成年SD雄性大鼠随机分为4组：假手术组、脑缺血组、配伍药物治疗组、阻滞剂组，每组12只。采用线栓法制作大脑中动脉闭塞模型。于缺血后24 h后行神经功能缺损评分，断头取脑行TTC染色检测脑梗死面积，实时荧光定量PCR法、蛋白质免疫印记法测缺血区脑皮质SHH、Patched-1、Gli-1mRNA及蛋白的表达。结果 配伍药物组缺损评分、脑组织梗死面积显著低于脑缺血组和阻滞剂组。脑组织shh 、Patched-1、Gli-1 mRNA及蛋白表达量显著高于脑缺血组，阻滞剂组Gli-1mRNA及蛋白表达量显著低于配伍药物组。结论 灯盏乙素与芍药苷配伍对大鼠局灶性脑缺血损伤具有一定的保护作用，其机制与上调Sonic Hedgehog(Shh)通路关键蛋白分子表达量有关。

灯盏细辛； 赤芍； 脑缺血； 配伍

脑梗死发病率为各类脑血管疾病之首，具有高发病率、高病死率、高致残率的特点[1，2]。目前最有效的治疗为溶栓和取栓[3]，但受治疗时间窗和适应证的限制，无法成为常规治疗手段[4]。灯盏细辛、赤芍配伍来源于民间组方，用于治疗卒中淤血阻络证及急性脑梗死等病症，有广泛临床应用基础、疗效确切。但其作用机制尚不明确，本实验通过观察灯盏细辛与赤芍配伍药对脑缺血大鼠脑组织SHH、Patched-1、Gli-1 mRNA及其蛋白的表达的影响，探讨灯盏细辛与赤芍配伍对脑缺血大鼠神经的保护作用和可能机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 48只SPF级雄性SD(Sprague-Dawley )大鼠，8～10周龄。体重为250～280 g，购自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)-2011-0015。

1.1.2 实验试剂 灯盏细辛粗提物、赤芍粗提物及环巴胺(Cyclopamine)(上海融禾医药科技)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(美国 Sigma)；Gli-1兔多克隆抗体购自(美国Santa Cruz)；SHH羊多克隆抗体(美国 Santa Cruz)；Patched-1兔多克隆抗体(美国Novus Biologicals)。All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit (美国GeneCopoeia)；All-in-OneTMqPCR Mix (美国GeneCopoeia)。基因序列查自美国国立生物技术信息中心(NCBI) 基因库，由生工生物工程有限公司设计，在NCBI Primer-BLAST进行特异性检验，引物序列由生工生物工程合成。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 购入动物后将所有动物按随机数字表法随机分为假手术组、脑缺血组、配伍药物组、阻滞剂组。配伍药物组与阻滞剂组于缺血后0 h、6 h分别腹腔注射配伍药物(灯盏细辛248 mg/kg+赤芍372 mg/kg)[5]，假手术组和脑缺血组于同一时间腹腔注射等量生理盐水。阻滞剂组于缺血前15 min腹腔注射Cyclopamine(6 mg/kg)，其他各组于同一时间腹腔注射等量生理盐水。

1.2.2 模型制作 购入动物后适应性喂养1 w,采用Longa线栓法建立永久性大脑中动脉阻塞脑缺血模型。模型制作时假手术组插入线栓距颈动脉分叉处10～12 mm，其余各组大鼠插入线栓距颈动脉分叉处18±0.5 mm(插入线栓感到阻力为止)。

1.2.3 神经功能评分 参照Zea-Longa 5分制评分标准:0分：无神经损伤症状；1分：对侧前爪不能完全伸展；2分：向外侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。缺血后3 h进行首次评分，评分为0分或4分的剔除(正常组0分的保留)，随机补充。缺血 24 h 对各组大鼠(各组6只，共24只)进行行为学评分并纪录。

1.2.4 TTC染色测脑梗死面积 将已行神经功能评分的大鼠(24只)麻醉处死后迅速断头取脑，于-20 ℃冰箱中速冻5 min，沿冠状位将鼠脑切开成5片，厚度约2 mm。置于2%TTC磷酸盐缓冲液中37 ℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定，24 h后拍照用Image J测定每张切片脑梗死面积。计算梗死面积百分比。

1.2.5 Real-time PCR检测SHH、Patched-1、Gli-1分子的mRNA表达 大鼠(每组6只，共24只)脑缺血24 h后断头取脑，取缺血区脑组织用液氮在研体中碾碎后加入trizol试剂(1 ml/50～100 mg)吹打混匀后按说明书提取总RNA。检测RNA浓度并电泳判断核酸完整性，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录获得cDNA，并按All-in-OneTMqPCR Mix 试剂盒说明书行实时定量PCR反应。以β-Actin为内参，采用2 -ΔΔCt法计算基因表达的差异[6]。

1.2.6 Western blod检测SHH、Patched-1、Gli-1 蛋白含量 大鼠(与PCR实验共用大鼠：每组6只，共24只)脑缺血24 h后断头取脑，取缺血区脑组织与RIPA裂解液按1 mg∶10μl比例于冰上匀浆后按说明书提取总蛋白。取总蛋白60 μl行BCA蛋白定量法测蛋白浓度。其总蛋白按1∶1比例加入上样缓冲液(2×)沸水中水浴5 min使其变性，SDS-PAGE电泳(上样量为30 μg/孔)后用半干转印仪转膜至硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，相应一抗4 ℃孵育过夜。第2天复温1 h后TBST洗涤3次，每次15 min。相应二抗孵育1 h，TBST洗涤3次，每次15 min。滴加ECL发光液后用暗盒于暗室曝光。拍照后用Image J分析条带平均灰度值。计算各组蛋白相对表达量(相对表达量=目的蛋白/内参蛋白)。

2 结 果

2.1 神经功能缺损评分 假手术组无神经功能缺损，其余各组大鼠手术后24 h均有不同程度神经功能缺损，各组间存在显著性差异(见表1)。配伍药物组神经功能缺损评分较脑缺血组显著减少(P<0.5)，阻滞剂组神经功能缺损评分较配伍组显著增加(P<0.001)。

表1 不同组别大鼠的神经功能缺损评分和脑梗死面积百分数

与假手术组比较aP<0.05；与脑缺血组比较bP<0.05；与配伍药物组比较cP<0.05

2.2 脑梗死面积 假手术组行TTC染色后未见梗死区，其余各组大鼠大脑染色均有不同范围的白色梗死区，各组间存在显著性差异(见表1)。配伍药物组梗死面积百分比较脑缺血组显著减少(P<0.05)，阻滞剂组梗死面积百分比较配伍药物组显著增加(P<0.05)

2.3 Real-time PCR检测SHH、Patched-1、Gli-1分子的mRNA表达情况 实时定量PCR显示：各组大鼠脑缺血24 h后SHH、Patched-1、Gli-1 mRNA表达水平存在显著性差异(见表2)。与假手术组相比，脑缺血组mRNA表达水平显著增高(SHH:P<0.05；Patched-1:P<0.05；Gli-1:P<0.05)。与脑缺血组相比，配伍药物组mRNA表达水平显著增高(SHH:P<0.05；Patched-1:P<0.05；Gli-1:P<0.05)。与配伍药物组相比，阻滞剂组Gli-1 mRNA表达水平显著降低(Gli-1:P<0.05)。

2.4 Western blod 检测 SHH、Patched-1、Gli-1 蛋白含量 蛋白免疫印迹法显示：大鼠脑缺血24 h后各组SHH、Patched-1、Gli-1蛋白表达水平存在显著性差异(见表2)。与假手术组相比，脑缺血组各蛋白表达水平显著增高(SHH:P<0.05；Patched-1:P<0.05；Gli-1:P<0.05)。与脑缺血组相比，配伍药物组各蛋白表达水平显著增高(SHH:P<0.05；Patched-1:P<0.05；Gli-1:P<0.05)。与配伍药物组相比，阻滞剂组Gli-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。

表2 不同组别大鼠脑组织的Shh、Patched-1、Gli-1 的mRNA及蛋白含量表达情况(n=6)

与假手术组比较aP<0.05；与脑缺血组比较bP<0.05；与配伍药物组比较cP<0.05

3 讨 论

灯盏细辛又名灯盏花、短茎飞蓬或灯盏草，为菊科飞蓬属植物短葶飞蓬[Erigeron breviscapus (Vaniot) Hand-Mazz]，以根或全草入药。微苦，甘温辛，性温。归心、肝经。灯盏细辛主要有效成分为黄酮类和咖啡酸酯类化学物质。灯盏细辛可通过调节脑缺血后的物质代谢，减轻脑水肿；改善记忆学习功能；具有抗抗炎、凋亡作用[7]。赤芍又名山芍药或草芍药，为毛茛科芍药属植物赤芍(PaeoniaIactiflora Pall)、草芍药(P.obovata Maxim)和川赤芍(P.veitchii Lynch)的根部。味苦，性微寒。归肝经。赤芍主要有效成分为单萜苷、多元酚类化学物质。在缺血再灌注模型中，赤芍可改善小鼠的学习记忆力及其空间分辨能力；降低NO毒性损伤及细胞内钙超载；协同神经生长因子诱导的神经元突触生长；抗血小板凝集、改善微循环[8]。民间组方灯盏细辛与赤芍配伍常用来治疗卒中、偏瘫，具有临床应用基础。研究表明灯盏花素和芍药苷配伍组方合理，具有明显的协同增效作用[9]。辛芍组方可改善脑缺血所致病理变化，增强病灶组织抗氧化和改善局部脑微循环血流[10]。本研究也证实灯盏细辛、赤芍组方能改善MCAO模型大鼠神经行为功能评分，减小梗死面积，有明确的神经保护功能。分泌蛋白Sonic Hedgehog是Hedgehog家族成员，与HH受体Ptched(12次跨膜蛋白)复合物结合。解除PTC对SMO(7次跨膜蛋白)的抑制。使转录因子Gli表达水平升高，Gli转移到细胞内启动相关蛋白的转录翻译[11]。SHH作为胚胎时期成形素对胚胎的发育至关重要，突变会导致前脑无裂脑畸形、多指(趾)、短指(趾)等[12]。SHH可维持干细胞分裂和促进增殖基因的表达，与多种肿瘤的发生和发展密切相关[13]。在脑组织缺血方面,激活Sonic hedgehog信号通路可以通过上调Bcl-2表达及下调caspase-3表达抗凋亡；调节谷胱苷肽、超氧化歧化酶、一氧化氮、乳酸脱氢酶丙二醛等表达抗氧化；促进缺血组织血管再生和神经修复，从而改善脑组织缺血缺氧。

本研究中，脑缺血后SHH蛋白表达增高，应用灯盏细辛与赤芍组方治疗脑缺血可使SHH信号通路关键蛋白表达上调，减轻脑缺血后神经功能缺损，减少脑梗死面积。环巴胺阻断治疗组SHH信号通路，可逆转灯盏细辛与赤芍配伍的保护效应。表明灯盏细辛与赤芍组治疗脑缺血的神经保护作用机制可能与增加SHH蛋白表达水平，激活SHH信号通路有关。本实验可为药物应用于临床提供实验依据，为下一步检测药物有效单体提供参考监测指标。但中药多为多靶点作用，灯盏细辛与赤芍组方作用是否有其他作用点激活相关信号通路与SHH协同作用有待进一步研究研究。

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Compatibility of erigeron breviscapus and radix paeoniae rubra protects rats against cerebral ischemic injury

FAN Yadan，HAN Jiangquan，DENG Caihong.

(Department of Neurology，the Fifth Affiliated (Zhuhai) Hospital,Zunyi Medical College,Zhuhai 519100,China)

Objective To investigate the protective effect of the compatibility of Erigeron breviscapus and Radix Paeoniae Rubra on cerebral ischemia injury rats and its possible mechanisms.Methods Forty-eight adult male Sprague-Dawley rats were divided into four groups randomly:a sham operation group,a cerebral ischemia group,a treatment group and an inhibitor group,12 in each group.MCAO model was performed according to Zea-longa’s report.Neurological deficit scores were performed after 24 h of the operation.Then decapitated the rats and took out their brain.Detected infarct size by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining,and detected the expression of the mRNA levels of Shh、Patched-1、Gli-1 by RT-PCR and assessed the proteins expression of them by Western blotting.Results The neurological deficit score and the infarct size in the treatment group were lower than that in the cerebral ischemia and inhibitors groups,both of the differences were statistically significant.RT-PCR and Western blotting suggested that the mRNA and protein levels of Shh、Patched-1、Gli-1 in the treatment group was higher than that in the cerebral ischemia group.The the GLI-1 level in the inhibitor group was lower than the treatment group．The differences were statistically significant.Conclusion The compatibility of Erigeron breviscapus and Radix Paeoniae Rubra has certain protective effect on permanent cerebral ischemia injury rats.Its mechanism was associated with the up-regulation of the expression of the key components of Sonic Hedgehog signaling pathway.

Erigeron breviscapus; Radix Paeoniae Rubra; Cerebral ischemia; Compatibility

1003-2754(2016)10-0894-03

2016-06-03；

2016-09-28

贵州省中医药、民族医药课题(黔中医药 20141433)；珠海市重点学科项目(珠卫 20088013)

(遵义医学院第五附属珠海医院，广东 珠海 519100)

韩江全，E-mail：gdshanjq@ 163.com

R743.3

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