蒙药嘎日迪-13对脑缺血大鼠不同时相海马中IL-1βIL-8、ICAM-1、P-selectin表达的影响

张浩楠， 郑延泽， 何静波， 田彩云， 武海军， 杨玉梅



蒙药嘎日迪-13对脑缺血大鼠不同时相海马中IL-1βIL-8、ICAM-1、P-selectin表达的影响

张浩楠， 郑延泽， 何静波， 田彩云， 武海军， 杨玉梅

目的 观察蒙药嘎日迪-13对脑缺血大鼠不同时相海马中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表达的影响。方法 360只雄性SD大鼠随机分为脑缺血模型组、假手术组、嘎日迪-13大、中、小剂量组，每组又随机分为6个时相组，灌胃给药，一次/d，连续27 d后，线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，神经功能评分后免疫组化法测定海马IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表达。结果 嘎日迪-13明显降低脑缺血大鼠神经功能评分，并明显降低脑缺血大鼠海马IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表达水平。结论 蒙药嘎日迪-13对大鼠脑缺血有较好的保护作用，其机制可能与降低IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin等因子的表达水平有关。

蒙药； 嘎日迪-13； 脑缺血； 大鼠； IL-1β； IL-8； ICAM-1； P-selectin

蒙医理论认为缺血性脑血管疾病属于白脉病范畴之内的“萨病”，发病原因为气血瘀滞导致血脉阻塞而使白脉之海-脑失去功能。嘎日迪-13是蒙医常用来治疗“萨病”的传统方剂之一，主要由诃子、制草乌、麝香、沉香等13味药组成，主治半身不遂、左瘫右痪、口眼歪斜、言语不清、筋骨疼痛、神经麻痹等症状，疗效明显。已有的研究表明[1～3]，嘎日迪-13对脑缺血有很好的保护作用，但缺乏实验机制的相关研究。本研究通过观察脑缺血后大鼠海马中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表达量，在前期研究基础上进一步探讨嘎日迪-13对脑缺血的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠，雄性，清洁级，360只，体重(200±50)g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证编号：SCXK(京)2011-0012。环境温度为22 ℃～26 ℃，按每笼6只饲养，试验期间各鼠均自由进行饮水摄食。

1.1.2 试剂和药物 嘎日迪-13，内蒙古奥特奇蒙药股份有限公司(金山)蒙药厂，批号：080905； IL-1 bs-6319R，IL-8 bs-0780R，ICAM-1 bs-4615R，P-selectin bs-0561R北京博奥森；PV-6000通用型二抗试剂盒，6 ml；ZLI-9018 DAB kit 3 ml；PBS缓冲液(0.01 mol;pH=7.2～7.4)；柠檬酸盐修复液(pH=6.0；0.01 mol)。其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器 Leica 2135石蜡病理切片机，德国Leica公司；YB-7B病理组织包埋机，安徽电子科学研究所；ZT-12P生物组织自动脱水机，湖北亚光医用电子技术有限公司；QP切片漂烘仪，安徽电子科学研究所；Leica激光共聚焦显微镜，德国Leica公司。

1.2 方法 动物分组及模型制备360只雄性SD大鼠，随机分为：脑缺血模型组(n=72)；假手术组(n=72)；嘎日迪-13大剂量组(n=72，1.2 g/100 ml)；嘎日迪-13中剂量组(n=72，0.6g/100 ml)；嘎日迪-13小剂量组(n=72，0.3 g/100 ml)。每个剂量组下分6个时相即1 h、6 h、12 h、24 h、72 h与120 h，72只大鼠随机分至6个时相，每个时相12只大鼠。各组大鼠均进行灌胃给药(2 ml/100 g，模型组与假手术组给予等体积生理盐水代替药物)，连续27 d，一次/d，末次给药后1 h开始造模。模型制备采用Longa[4]的线栓法加以改良制作大脑中动脉缺血模型。

1.3 取材 在规定时间点，以3%戊巴比妥钠(0.1 ml/100 g)麻醉大鼠，剪开胸壁，暴露心脏，用室温生理盐水通过左心尖部，沿升主动脉灌注冲血，同时剪开右心耳，可见右心耳流出液体的颜色逐渐由鲜红色变为淡红色,至基本无色为止，换4%甲醛灌流，至大鼠肢体、尾巴僵直，即表明固定成功。开颅取脑，缺血侧脑组织样本放置于4%甲醛内固定24 h，进行免疫组化试验。

1.4 指标检测

1.4.1 神经功能评分测定 参照Longa评分标准分为5个等级：0分：无神经功能缺失症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向外侧转圈(追尾现象)；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

1.4.2 免疫组化观察脑缺血大鼠海马不同时相IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表达量 石蜡包埋，切片，65 ℃烤片1 h待用，其余步骤严格按照试剂盒说明书严格操作。空白对照一抗为PBS。阳性反应为细胞浆棕黄色深染，镜下(×400)随机观察缺血区域不重叠的5个视野，计数各因子胞浆阳性细胞数，取平均值。

2 结 果

2.1 嘎日迪-13对脑缺血大鼠神经功能评分的影响 与假手术组比较，脑缺血模型组大鼠各时相神经功能评分明显升高；与脑缺血模型组比较，嘎日迪-13各组大鼠神经功能评分明显降低(见表1)。

2.2 嘎日迪-13对脑缺血大鼠不同时相海马IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表达量的影响 脑缺血后1 h，模型组大鼠海马中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表达量明显升高(P<0.01)，并在24 h达到峰值后呈逐渐下降趋势；与脑缺血模型组比较，嘎日迪-13组大鼠各时相海马中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表达量明显降低(P<0.05，P< 0.01)(见表2～表5)。

表1 嘎日迪-13对脑缺血大鼠神经功能评分的影响±s ，n=8)

与假手术组比较*P<0.01；与模型组比较#P<0.01

表2 嘎日迪-13在不同时相对局灶性脑缺血大鼠海马中IL-1β表达量的影响±s，n=8，ng/L)

与假手术组比较*P<0.01；与模型组比较#P<0.01

表3 嘎日迪-13在不同时相对局灶性脑缺血大鼠海马中IL-8表达量的影响( ±s，n=8，ng/L)

与假手术组比较*P<0.01；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01

表4 嘎日迪-13在不同时相对局灶性脑缺血大鼠海马中ICAM-1表达量的影响±s，n=8，ng/L)

与假手术组比较*P<0.01；与模型组比较#P<0.01

表5 嘎日迪-13在不同时相对局灶性脑缺血大鼠海马中P-selectin表达量的影响

与假手术组比较*P<0.01；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01

3 讨 论

近年来对脑缺血损伤的作用机制有了非常深入细致的研究，从整体到分子水平的大量实验研究表明[5]，炎症反应在缺血性脑损伤的发生和发展中起着至关重要的作用，炎症反应重要的病理变化是脑微血管内白细胞聚集变形穿越血管，然后浸润脑组织，整个过程中还会伴有微血管循环功能障碍，脑组织水肿和血浆蛋白聚集。可见，白细胞与血管内皮细胞的粘附是脑缺血炎症损伤的开端。

粘附分子在炎症反应起始阶段介导了白细胞向血管内皮细胞的滚动，其可分为3个家族：选择素家族、可识别整合素的免疫球蛋白超家族成员和整合素家族。

选择素是在血小板、血管内皮细胞和白细胞表面表达的一种表面糖蛋白，根据表达部位不同可分成3类：P-selectin，表达于活化的血小板和内皮细胞表面；E-selectin，表达于活化的血管内皮细胞表面；L-selectin，表达于白细胞表面[6]。P-selectin在细胞受到刺激之后可通过质膜融合的方式迅速表达于细胞表面，或者在4～6 h之后通过mRNA的转录及翻译再表达。大鼠MCAO再灌2～24 h均可检测到P-selectin存在，且与白细胞-内皮细胞粘附迁移和组织水肿形成的部位一致[7]。临床研究也发现，血栓性疾病的早期阶段血中P-selectin增高可反映体内血小板活化程度,尤其是短暂性脑缺血发作和急性脑梗死等缺血性脑血管疾病患者[8]。

ICAM-1属于免疫球蛋白超家族，生理状态下呈低表达，其主要受体是整合素家族的CD11a/CD18。ICAM-1与其受体结合后，在介导白细胞向炎症区移行及淋巴细胞归巢和再循环的进程中起重要作用。有学者发现[9,10]，大鼠脑缺血2～6 h后，缺血区及周边微血管内ICAM-1表达明显增加，至24～48 h达到峰值，其表达程度的增加比TNF-α和IL-1β稍晚[11]。近年临床研究也发现，可溶性ICAM-1在急性缺血性脑病患者脑脊液和血浆中含量显著升高,而且发现ICAM-1表达水平的高低与脑缺血损伤程度成正相关[12,13]。

IL-1β在缺血脑损伤过程中是重要的一个致炎因子。IL-1β是IL-1在脑组织、血浆和组织液中的一种存在形式，在其他因子协同下促进T淋巴细胞和B淋巴细胞活化，更重要的是其可诱导ICAM-1、IL-8表达上调，进一步诱导白细胞与内皮细胞的粘附、聚集加重炎症反应程度[14]。有研究显示，脑缺血后IL-1β可在脑组织、脑脊液和血清中检测到异常增加[15]。脑组织、血浆和脑脊液中IL-1β表达明显上调，提高血小板活化因子水平，改变内皮细胞的抗凝血功能，进一步加快血栓的形成[16]。

IL-8可来源于多种细胞，是一种非常重要的趋化因子，是一类典型的炎症介质，其可趋化激活中性粒细胞并参与中性粒细胞与内皮细胞粘附过程的调节[17]。IL-8及其相关趋化性多肽亦可迅速趋化活化整合素α、β链的连接分子，增加白细胞与内皮细胞的黏附和跨膜移行[18]，并诱导ICAM-1的表达上调。有学者发现[19]，大鼠脑缺血再灌3 h后，缺血区IL-8浓度升高，12 h达到峰值。临床研究发现缺血性脑血管疾病患者血清IL-8含量高于正常人，且大面积梗死患者血清IL-8含量高于小面积梗死患者，提示IL-8与脑缺血后损伤有关[20]。

本研究通过对大鼠神经功能评分观察，显示嘎日迪-13对脑缺血具有很好的保护作用。且嘎日迪-13能够明显降低脑缺血大鼠各时相海马中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表达水平。表明嘎日迪-13可在不同时相，不同靶点抑制脑缺血后白细胞迁移浸润和炎症反应对神经的损伤。所以提示嘎日迪-13抑制炎症因子和黏附因子的表达可能是其对脑缺血保护作用的机制之一。

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Influence of mongolian medicine garidi-13 on the expression of IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin at different phase of cerebral ischemic rats hippocampus

ZHANG Haonan,HENG Yanze,HE Jingbo,et al.

(Baotou Medical College,Inner Mongolia,Baotou 024000,China)

Objective To observe the influence of Mongolian Medicine Garidi-13 on the expression of IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin at different phase of cerebral ischemic rats hippocampus.Methods 360 male SD rats were randomly divided into vehicle control group,sham-operated group,Gridi-13 large dose group,Gridi-13 middle dose group and Gridi-13 small dose group,then each group was divided into the ischemia 1 h,6 h,12 h,24 h,72 h and 120 h phases.Lavage rats with Garidi-13 once a day till 27th,then established cerebral ischemia model with Suture method cerebral ischemia model.After having recorded the neurofunctional score,their brain samples were collected for immunohistochemical staining of IL-1β,IL-8,ICAM-1 and P-selectin.Result The expressions of hippocampal IL-1β,IL-8,ICAM-1 and P-selectin in the model group were significantly higher than those in vehicle group (P<0.01).According to the results of immunohistochemical staining,the Garidi-13 groups could inhibit the expression of IL-1β,IL-8,ICAM-1,P-selectin.Conclusion Garidi-13’s protective mechanism for brain tissues of cerebral ischemic rats may be related to its effects in inhibiting IL-1β,IL-8,ICAM-1,P-selectin expression.

Mongolian Medicine; Garidi-13; Cerebral Ischemic; Rats; IL-1β; IL-8; ICAM-1; P-selectin

1003-2754(2016)10-0905-04

2016-06-02；

2016-09-29

国家自然科学基金项目(No.81160560)

(包头医学院 药学院，内蒙古 包头 014000)

杨玉梅，E-mail：yym457@aliyun.com

R743.3

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