NT-3转染骨髓间充质干细胞对脑缺血再灌注的机制研究

宗海斌， 尉 娜， 崔明星， 董玉珍



NT-3转染骨髓间充质干细胞对脑缺血再灌注的机制研究

宗海斌1， 尉 娜2， 崔明星3， 董玉珍3

目的 研究神经营养素-3( neurotrophin-3，NT-3)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法 制作脑缺血再灌注损伤模型，将60只大鼠根据注射物不同分为3组：生理盐水对照组、BMSCs组和NT-3+BMSCs组(n=20)，观察不同时间3组大鼠的神经学功能评分、脑组织光镜观察、TUNEL法检测神经元细胞的凋亡及丙二醛含量情况。结果 BMSCs+NT-3组移植后大鼠神经学功能评分较BMSCs组低，而BMSCs组较NS组较低,两组间比较均有统计学意义(P<0.05)；BMSCs+NT-3组脑组织光镜观察细胞形态学变化最轻；BMSCs组神经元凋亡较NS组减少，BMSCs+NT-3组的神经元凋亡数量较BMSCs组减少，两组间比较均有统计学意义(P<0.05)；NS组丙二醛(MDA)含量明显高于BMSCs组(P<0.05)；而BMSCs+NT-3转染组明显低于BMSCs组(P<0.05)。结论 大鼠BMSCs经NT-3转染后相互促进，移植于急性脑缺血再灌注损伤通过减缓神经元细胞凋亡、降低丙二醛含量抑制自由基的脂质过氧化反应进行修复。

神经营养素-3； 骨髓间充质干细胞； 神经元凋亡； 脑缺血再灌注损伤； 机制

随着老龄化社会和生活压力增加，缺血性脑血管病成为临床的主要疾病，具有高发病率、高致残率、高致死率等特点，严重威胁人类的健康和生活质量 。脑缺血再灌注损伤是指在损伤因素作用下经一定时间缺血后得到血液再灌注继而导致缺血，局部神经元和胶质细胞缺血缺氧，发生脑组织中心性坏死出现明显的功能障碍[1,2]。它是多种因素参与而引发的脑组织进行性、毁损性的破坏甚至出现不可逆性神经元迟发性死亡的现象[3]。了解脑缺血再灌注的机制及时终止脑组织缺血后自毁性联锁反应是改善继发性损伤的理想策略。

神经营养素-3(NT-3)能够维持运动神经元和神经胶质细胞的存活，促进神经-肌突触的成熟，对缺血后神经功能康复有促进作用[4]。但吸收率低，不能持续作用。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是具有多方向分化潜能的干细胞，能够分泌多种生物活性物质，促进血管、髓鞘神经再生和突触联系，抑制细胞凋亡，调节炎症反应[5,6]。将NT-3基因转染入BMSCs具有相互促进作用,但尚未见联合用于治疗脑缺血再灌注损伤的研究报道。本实验将NT-3+BMSCs移植于缺血再灌注损伤脑组织中，观察其对损伤脑组织的作用效果，探讨其对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 将60只SD雄性大鼠(体重180～200 g)。以40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，消毒、固定。将60只大鼠根据注射物不同随机分为3组：分别于造模后30 min给予尾静脉注射0.1 ml生理盐水、1×106/ml BMSCs和NT-3+BMSCs(NT-3转染入已分离、培养的BMSCs)分为NS组、BMSCs组、NT-3+BMSCs组 (n=20)。注射后动物常规分笼饲养。

1.2 试剂 NT-3质粒(北京塞百盛生物工程有限公司合成提纯)、纳米微球转染试剂盒(美国Sigma生物公司)； HE免疫组化染色(湖北武汉博士德生物工程有限公司)；凋亡细胞试剂盒(美国Sigma生物公司)。恒温培育箱、离心机、冰冻切片机(德国Leica 公司)；荧光显微镜及成像系统(日本Nikon公司)；TJTY-300图像分析软件及光镜(日本Philips 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠脑缺血再灌注模型制作 采用Zea Longa改良线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。取颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在 CCA 远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA，近心端结扎CCA、ECA，然后在距CCA 分叉部4 mm剪一小口，将栓线插入到ICA，用绕在CCA远心端的细线系牢栓线。从血管分叉处计算插入18 mm 时，系牢 CCA 远心端的细线。阻断血流2 h 后抽出栓线，再灌注时间为24 h。大鼠术后肌注庆大霉素预防感染。

1.3.2 神经学功能评分 各组大鼠在术后6 h、12 h、24 h、48 h清醒后，进行神经功能体征评分，1～3分的大鼠为造模成功，对于不符合条件的大鼠预以剔除。0分：正常，无任何神经功能损伤;1 分:对侧前肢蜷曲不能完全伸展，轻度神经功能缺损;2分:行走时，大鼠向瘫痪侧转圈，为中度神经功能缺损;3分:行走时身体向瘫痪侧倾倒，重度神经功能缺损;4分:意识丧失不能自发行走。 评分越高，说明神经损伤障碍越严重。

1.3.3 HE染色 于注射分组后12 h、24 h麻醉大鼠，快速取各组大鼠大脑至培养皿中，置于体积分数4%多聚甲醛缓冲液中固定，脱水，石蜡包埋，连续切片厚约2 μm的组织切片，经HE染色，取互不重叠的5个视野在400倍光学显微镜下观察。

1.3.4 Tunel检测神经元凋亡 于移植后12 h、24 h、48 h，麻醉下取各组大鼠脑组织切片，用4%多聚甲醛溶液4 ℃固定2 h，置入30%蔗糖溶液过夜后采用恒冷箱-25 ℃切片法连续冰冻切片厚约3 μm的组织切片，做TUNEL荧光染色，按试剂盒说明操作，400倍视野荧光显微镜下观察(蓝色光激发)，计算平均凋亡细胞数量。

1.3.5 脑组织丙二醛含量的测量 于移植后6 h、12 h、24 h、48 h称取各组脑组织湿质量100 mg，冰上匀浆后待测。采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 神经学功能评分 于移植后6 h、12 h、24 h、48 h，大鼠清醒后，对其进行神经行为学评价，NT-3+BMSCs组平均分数最低，与BMSCs移植组和NS对照组比较差异有显著性意义(P<0.05),而BMSCs移植组和NS对照组比较差异亦有显著性意义(P<0.05)(见图1)。

2.2 大鼠脑形态学观察结果 12 h大鼠脑组织HE染色观察见BMSCs+NT-3组脑组织细胞形态结构基本清晰，神经元较大而多角，细胞核较清晰，胞浆丰富，空泡较少；NS组出现明显的组织炎性细胞浸润,组织充血，神经元胞体胀大，胞核不清，胞浆中出现空泡状改变，BMSCs介于两组之间，脑组织病理变化明显较NS组减轻,24 h后3组变化更加明显(见图 2)。

2.3 TUNEL法神经元凋亡检测 术后12 h、24 h、48 h NS组大鼠脑组织内出现较多的染色阳性神经元细胞凋亡，细胞核固缩，颗粒深染，形态不规则，而神经元数量较少；BMSCs组神经元凋亡较NS组减少，BMSCs+NT-3移植组的染色阳性的神经元凋亡数量较少、染色强度弱；而细胞凋亡率NS组均高于其他组， BMSCs组显著高于BMSCs+NT-3移植组,比较均有统计学意义(P<0.05),3组随着时间延长凋亡数量和凋亡率均逐渐增加(见表1)。

2.4 丙二醛含量活性测定 缺血再灌注6 h、12 h、24 h、48 h NS注射组大鼠脑组织组织中丙二醛(MDA)含量明显高于BMSCs组(P<0.05)；而BMSCs+NT-3转染组MDA含量明显低于BMSCs组,两组比较均有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表1 各组神经元细胞凋亡率检测结果比较 ±s)

BMSCs+NT-3组与NS组相比*P<0.05;与BMSCs组相比#P<0.01

表2 各组大鼠不同时间点MDA含量的比较±s,n=20)

BMSCs+NT-3组与NS组相比*P<0.05;与BMSCs组相比#P<0.01

图1 各时间点3组大鼠脑组织神经学功能评分比较

A:12 h NS组；B:12 h BMSCs组；C:12 h BMSCs+NT-3组成；D:24 h NS组；E:24 h BMSCs组；F: 24 h BMSCs+NT-3组

图2 12 h、24 h各组脑组织HE染色比较×400

3 讨 论

脑缺血再灌注后，氧自由基介导的脂质过氧化反应、钙离子超载、兴奋性氨基酸、前列腺素等因素在损伤机制中起着重要作用，氧化应激大量自由基的产生可氧化细胞内的蛋白质、脂质和核酸，导致细胞损伤、凋亡。缺血时间的不同决定再灌注后脑组织功能是否可以恢复[7]。BMSCs 可在体内和体外诱导下跨胚层分化为具有神经元或胶质细胞表型的细胞，能分泌大量有益于神经再生的营养因子，可促进轴突再生和髓鞘形成、迁移的分子保护损伤神经细胞存活并促进其再生而达到修复神经系统的作用[8]。研究表明：BMSCs在一定条件下可跨胚层诱导分化为外胚层的神经胶质细胞和神经元样细胞，且部分具有神经元的电生理特性。并且移植BMSCs通过抑制氧自由基的生产来促进其他组织缺血再灌注损伤的恢复[9,10]。

Ito等[11,12]实验研究表明利用DNA测序方法检出脊髓内存在EGF受体(EGFR)、FGF受体(FGFR)等受体，可以促进BMSCs的增殖,当以上生长因子单独或联合作用于BMSCs时,可以与BMSCs的表面受体结合,进一步激活一系列的胞内反应,促使BMSCs向神经细胞分化。NT-3通过与这些受体的胞外区结合，将神经细胞存活和分化的信号传递到细胞内部，促进BMSCs向神经元细胞的增殖与分化，可以激活MAPK途径,促进细胞外基质蛋白的分泌，对神经元细胞的成熟和存活起到非常重要的作用。脑缺血再灌注损伤后BMSCs提高神经系统的血管再生可以促进损伤神经元的恢复，减轻脑缺血的后遗症，改善脑缺血后康复的临床效果[13,14]。

实验研究证实脑缺血再灌注后引起一系列损伤性生化改变将导致细胞内钙聚集，氧自由基清除系统受到破坏或抑制含量增高，大量自由基的产生是继发脑组织损伤的重要病理生理环节[15]。丙二醛是脂质过氧化最终产物,对膜蛋白受体有很强的破坏作用,测定丙二醛含量的变化一定程度上可以反映组织细胞抗氧化能力，表明机体受自由基攻击的MPO严重程度，是判断脑组织内自由基清除的检测指标之一[16]。通过实验显示:NS注射组大鼠缺血再灌注脑组织中MDA含量明显高于BMSCs组；经BMSCs+NT-3转染后，丙二醛含量明显低于BMSCs组，两组比较均有统计学意义(P<0.05)。说明BMSCs经NT-3转染后降低机体内MDA含量，即提高了清除氧自由基的能力明显增强,可以有效的保护脑组织内细胞受到缺血再灌注损伤。

通过将NT-3+BMSCs移植于脑组织缺血再灌注检测术后不同时间NT-3+BMSCs组神经学功能评分最低，与BMSCs移植组和NS对照组比较差异有显著性意义(P<0.05),而BMSCs组功能评分比NS组减低，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。BMSCs+NT-3转染组脑组织光镜观察细胞形态学变化最轻；而神经元凋亡数量较少、染色强度弱,肌细胞凋亡率NS组均高于其他组，BMSCs组显著高于BMSCs+NT-3移植组,比较均有统计学意义(P<0.05),3组随着时间延长凋亡数量和凋亡率均逐渐增加。结果显示：BMSCs能够明显减少血中MDA含量 ,并且促进神经元细胞增殖减少凋亡,而经NT-3转染后的BMSCs的作用更强，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

因此,本研究认为BMSCs对脑缺血再灌注损伤有修复神经、阻止神经元凋亡和清除氧自由基的作用，经NT-3转染后可以相互增强作用,BMSCs+NT-3通过抑制自由基的脂质过氧化反应,促进组织细胞抗氧化能力、减缓神经元细胞凋亡达到了对脑缺血再灌注损伤的保护作用。

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The mechanisms of neurotrophin-3 transferred into bone marrow mesenchymal stem cells on cerebral ischemia-reperfusion injury

ZONG Haibin,WEI Na,CUI Mingxing,et al.

(Skill Laboratory of Basic Medical Science of Xinxiang Medical College，Xinxiang 453003 China)

Objective To observe the mechanisms of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) by transferred neurotrophin-3 with nanoparticle repaired cerebral ischemia-reperfusion injury of adult rat.Methods BMSCs isolated primarily were transfered NT-3 with nanoparticle carrier,the 60 adult rats of cerebral ischemia-reperfusion injury model were divided into group of NS group、BMSCs group and BMSCs+NT-3 transplanted.The nerve function was evaluated at the different times.The cross section of brain tissue and neuron cell apoptosis were observed after being transplanted into cerebral ischemia- reperfusion injury.Levels of malondialdehyde (MDA) was analyzed.Results After BMSCs+NT-3 treated brain cerebral ischemia-reperfusion injury,the score of nerve function was significantly lower than those of BMSCs,and BMSCs group showed lower than NS group,the differences were statistically significant(P<0.05);HE staining showed cell structure significantly improved and nuclear structure became clear after BMSCs+NT-3 treated;TUNEL study showed apoptosis cells were significantly decreased of BMSCs+NT-3 group compared to other groups,the difference was statistically significant(P<0.05).In NS group the contents of MDA showed significantly higher than BMSCs group at the same time,BMSCs+NT-3 group was lower than BMSCs group,there were statistical significance (P<0.05).Conclusions BMSCs by transferred NT-3 could be induced each other,which transplanted into cerebral ischemia-reperfusion injury model,can repair brain tissue by alleviating neuron cells apoptosis and inhibiting the lipid peroxidation of free radicals by decreasing the contents of MDA.

Neurotrophin-3; Bone mesenchymal stem cells; Neuron cells apoptosis; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Mechanisms

1003-2754(2016)10-0912-04

2016-06-29；

2016-09-29

(1.新乡医学院基础医学院机能实验室，河南 新乡 453003；2.新乡医学院第三附属医院神经内科，河南 新乡 453003；3.新乡医学院第一附属医院骨外二科，河南 卫辉 453100)

董玉珍，E-mail：394331568@qq.com

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