测序法筛选慢性阻塞性肺疾病尼古丁受体CHRNB4基因外显子单核苷酸多态性

赵祝香 彭 芳 何 桦 李裕军 曾 军 赵子文

(1广州医科大学附属市一人民医院呼吸内科, 广东 广州 510180；2广州医科大学附属第三医院呼吸内科, 广东 广州 510150；3广州市荔湾区第二人民医院呼吸内科, 广东 广州 510160)



·论著·

测序法筛选慢性阻塞性肺疾病尼古丁受体CHRNB4基因外显子单核苷酸多态性

赵祝香1*彭 芳2何 桦1李裕军1曾 军1赵子文1

(1广州医科大学附属市一人民医院呼吸内科, 广东 广州 510180；2广州医科大学附属第三医院呼吸内科, 广东 广州 510150；3广州市荔湾区第二人民医院呼吸内科, 广东 广州 510160)

目的:寻找中国南方汉族人群尼古丁受体(CHRNB4)基因功能区与慢性阻塞性肺疾病(COPD)疾病相关的单核苷酸多态性位点(SNP)。方法:在广州地区抽取按照慢性阻塞性肺疾病全球创议(GOLD)诊断标准(扩张后FEV1/FVC<70%)确诊的汉族COPD患者120例，按年龄(±3岁)与病例频数匹配原则选取非COPD对照者120例,病例组来自广州医科大学附属市一人民医院住院及门诊患者，对照组来自门诊志愿者。抽取受试者外周血提取基因组DNA，利用Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)查寻 CHRNB4 的全基因组序列，以Oligo6引物设计软件设计包括全外显子序列在内的测序引物5对，焦磷酸法 DNA测序，Bio Edit分析软件对测序序列进行比对及基因分型分析。结果:通过第一代测序，快速筛选出中国汉族人群CHRNB4外显子区3个SNP，分别为 rs56218866、rs6743072、rs1948。其中rs56218866可引起氨基酸位点改变。结论：通过第一代测序，可以简单、快速筛选出中国南方汉族人群与尼古丁受体CHRNB4外显子功能区和COPD易感性相关的SNP位点。

尼古丁受体；筛选；单核苷酸多态性

慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺，COPD)在全世界范围内是一种发病率和死亡率较高的重要疾病，我国40岁以上人群慢阻肺患病率高达8.2%[1]。家系研究表明，慢阻肺和肺功能损害存在明显家族聚集倾向。近年来，国内外对慢阻肺的遗传易感基因进行了许多探索性的研究，但结果不尽一致。迄今为止，唯一公认、也是最早认识的慢阻肺遗传危险因素是严重α1-抗胰蛋白酶缺乏[2-5]，但只有1%～2%的慢阻肺患者存在α1-抗胰蛋白酶缺乏。研究发现高加索人群尼古丁受体CHRNB4与吸烟成瘾性及肺癌易感性相关[6-7]，但是，此前有关对于尼古丁受体CHRNB4 单核苷酸多态性位点(SNP)多态性位点研究多来源于HapMap数据库，而尼古丁受体基因多态性存在较大的种族差异，HapMap数据显示尼古丁受体rs8034191及rs16969968位点组成的rs16969968的单倍体型在欧洲祖先的人群中携带频率约为50%，但在亚洲人群罕见，在非洲人群未观察到[8]。这就意味着以欧洲祖先的人群为基础研究发现的SNP不一定适用于中国汉族人群，而我们国内的基因多态性研究大多在分析高加索人群SNP位点后对亚洲人群中进行验证[9]。这样可能未找到符合中国人群的真正全面的SNP位点。这些SNP多为常见变异，对那些低频变异的位点检出效能不够，从而有可能漏掉了真正有意义的SNP位点。而且，这些位点多位于内含子区域，最近有研究将GWAS所发现的疾病关联SNP进行分类，结果发现大部分变异位于基因间(43%)和内含子区域(45%)；只有少部分位于基因的功能区域[10]，这些非功能区的变异很难明确其在疾病发生发展中的作用，直接检测功能区的变异可能更能明确其在疾病发生发展中的作用。而非功能区域，其临床意义有限。因此，有必要对中国慢阻肺人群中的尼古丁受体CHRNB4外显子进行测序，筛选出适合中国人群的有功能的尼古丁受体SNP位点。

1 研究对像及方法

1.1 研究对象

在广州市第一人民医院取按照GOLD诊断标准(扩张后FEV1/FVC<70%)确诊的汉族慢阻肺患者120例，按年龄(±3岁)与病例频数匹配原则选取非慢阻肺对照者120例进行CHRNB4 基因外显子测序筛选SNP。慢阻肺选择标准：在本实验室前期建立的慢阻肺病例资源库中随机抽取自中长期居住于广东的中国南方汉族慢阻肺稳定期的受试者；病史、体检、胸片符合中华医学会呼吸病学分会制定的慢阻肺诊治指南(2007年)；试验前1个月内无急性上呼吸道感染病史；肺功能测定：FEV1/FVC<0.70，支气管扩张试验阴性；除外合并支气管扩张、肝硬化、肺纤维化的患者；非慢阻肺对照者选择标准：长期居住于广东的中国南方汉族的非慢阻肺受试者；试验前1个月内无急性上呼吸道感染；胸片检查未见异常；肺功能测定：FEV1/FVC≥0.70预计值；其亲属中均未患慢阻肺和支气管哮喘者；除外支气管哮喘、支气管扩张、肝硬化、肺纤维化的患者。

1.2 试验方法

QIAGEN DNA提取试剂盒基因组DNA，利用Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)查寻nAChRs的候选基因 CHRNB4 的全基因组序列，以Oligo6引物设计软件设计包括全外显子序列在内的测序引物5对，测序引物由英韦创津公司合成，引物序列见表1。DNA测序按我们以住研究进行[11]，BioEdit序列比较软件将测序结果与Genebank提供的CHRNB4外显子序列进行比对及基因分型分析。用紫外分光光度计进行DNA含量及纯度的检测，以基因计数法直接计算各组的基因型和等位基因频率以Hardy-Weinberg遗传定律检测SNP是否符合遗传平衡。

表1 CHRNB4外显子测序引物序列

1.3 统计分析

应用SPSS16.0统计软件对数据进行统计分析。计数资料采用四格表卡方检验比较组间差异。

2 结 果

从CHRNB4序列中筛选出包括外显子在内的10个SNP位点，其中外显子编码区3个突变位点，通过与Pubmed SNP库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=CHRNB4)比对，发现这3个突变位点分别为CHRNB4第5外显子rs56218866、rs6743072、rs1948。见表2，图1。CHRNB4编码区3个SNP位点的特点，其中rs56218866可引起氨基酸改变。进一步研究发现rs56218866风险等位基因G等位基因频率及基因型频率有显著性差异，杂合突变、纯合突变基因型AG/GG频率为0.217(P<0.05)。见表3。

注：A：通过BioEdit序列比对筛选出rs56218866，序列分析为GG型、AG型及AA型；B：通过BioEdit序列比对筛选出rs6743072，序列分析为CC型、CT型及TT型；C：通过BioEdit序列比对筛选出rs1948,序列分析为CC型、CT型及TT型；红色箭头表示测序筛选的位点rs56218866、rs6743072、rs1948；白色箭头表示基因型序列分析图

图1 CHRNB4外显子测序筛选的rs56218866,rs6743072,rs1948位点序列及基因型

表3 CHRNB4外显子测序筛选的SNP基因分型频率

3 讨 论

本研究通过第一代测序成功筛选并鉴定出中国南方汉族人群尼古丁受体CHRNB4外显区与COPD易感性相关的SNP。第一步对CHRNB4外显子进行小样本(80例)焦磷酸测序，成功从中国南方汉族人群筛选出CHRNB4外显子编码区3个突变位点rs56218866、rs6743072、rs1948。其中引起氨基酸改变位点1个为 rs56218866，远低于Pubmed SNP库中所公布的96个(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term= snp/?term=CHRNB4+AND+HOMO)，也不同于加拿大高加索人群所验证的SNP( rs11636605 T→C,rs12914008T→C ,rs17487223T→C,rs6495309T→C rs950776G→A)[12],提示中国南方汉族人群CHRNB4 SNP 与其他人群存在较大的差异。

CHRNB4第5外显子rs56218866风险导位基因型AG/GG频率为0.217(P<0.05)，远高于高加索人群风险等位基因频率0.031，该基因频率及基因型频率在中国南方人群属高频变异，达21.7%，其风险等位基因与慢阻肺遗传易感性相关。rs56218866突变亦可引起第140位氨基酸丝氨酸转变为甘氨酸，由于丝氨酸为极性中性氨基酸，而甘氨酸为非极性脂肪族氨基酸，此改变引起氨基酸极性改变，从而可能影响其二级结构及三级结构，导致其蛋白质功能改变。

总之,通过第一代测序，可以简单、快速、筛选出中国南方汉族人群与CHRNB4外显子功能区与COPD易感性相关的SNP位点。

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(本文编辑：刘新艳)

DNA sequencing for screening single nucleotide polymorphisms of nicotine receptor gene exon CHRNB4 in chronic obstructive pulmonary disease patients

Zhao Zhuxiang1*,Peng Fang2,He Hua1,Li Yujun1,Zeng Jun1,Zhao Ziwen1

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,GuangzhouFirstMunicipalPeople′sHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180;2DepartmentofRespiratoryMedicine,ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150;3DepartmentofRespiratoryMedicine,LiwanDistrictSecondPeople′sHospital,Guangzhou510160)

Objective:To identify the single nucleotide polymorphisms (SNP) on functional gene domains of nicotine receptor (CHRNB4) associated with susceptibility of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in southern Chinese Han population. Methods:Included in this study were 120 Han patients with COPD in Guangzhou diagnosed according to Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) (post-bronchodilator FEV1/FVC<70%). Based on matching for age (±3 years) and number of cases,120 non-COPD subjects were recruited as the control group. All COPD subjects were inpatients or outpatients at the Guangzhou First Municipal People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University,and the control group consisted of clinic volunteers. The study subjects received phlebotomy for extraction of genomic DNA. The complete genome sequence of CHRNB4 was retrieved from Pubmed (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gene/). Five pairs of primers containing full-length of DNA sequences of the exon were designed by using Oligo6 primer design software. Pyrophosphate DNA method was used for the sequencing. Bio Edit software was used for the sequence comparison and genotyping analysis. Results:First-generation sequencing quickly identified three SNPs at the CHRNB4 exon of Chinese Han population:rs56218866,rs6743072,and rs1948. Of these,only rs56218866 resulted in a change in amino acids. Conclusion:First-generation sequencing can be simple and quick in screening the SNP at the functional domains of nicotine receptor CHRNB4 exon associated with susceptibility to COPD in southern Chinese Han population.

nicotine receptors; screening; single nucleotide polymorphisms

10.3969/j.issn.2095-9664.2016.04.01

广东省科技厅项目(2013B021800069)；广东省医学科研基金(A2014547)

R562

A

2095-9664(2016)04-0001-04

2016-06-21)

*通讯作者：Email：zhaozhuxiang@126.com

*Correspondingauthor:Email:zhaozhuxiang@126.com