缺血性脑损伤神经细胞凋亡及其相关基因的表达*

曹丽霞，杨玉梅

(包头医学院，内蒙古 包头014060)

缺血性脑损伤神经细胞凋亡及其相关基因的表达*

曹丽霞，杨玉梅

(包头医学院，内蒙古 包头014060)

缺血性脑损伤后神经元的死亡包括凋亡和坏死，近年来，缺血性脑损伤的研究中主要集中在缺血后的细胞凋亡过程。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是指在某些生理或病理刺激诱导下，机体为维护内环境的稳定，通过多种调控因子相互激活和表达，激活DNA内切酶，从而使细胞正常死亡的过程。细胞凋亡主要发生在缺血周围区，是一种涉及多种基因及其蛋白相互作用的自主死亡的过程。因此，对脑缺血后神经元损伤的作用靶点和作用机制进行系统深入的研究具有重要意义。

1 细胞凋亡通路

1.1 Caspase依赖性凋亡通路

1.1.1 内源性线粒体通路 缺血性脑损伤后，由于线粒体通透性转位孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)在各种凋亡诱导因素刺激下不可逆地过度开放，导致细胞色素C、丝氨酸蛋白酶(high temperature requirement protein A2，HtrA2)、第二线粒体衍生的天冬氨酸蛋白水解酶激活剂(second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)等从线粒体膜间隙释放至胞浆内［1］。细胞色素C与凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)结合形成凋亡小体，活化Procaspase-9，导致Caspase-3激活，介导细胞凋亡［2］;此外，当神经细胞发生凋亡时，SmacDIABLO能通过和凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)结合抑制活化的Caspase-9，促进Caspase-3的激活，引起细胞凋亡［3］。

1.1.2 外源性死亡受体通路 死亡受体(death receptor，DR)属于肿瘤坏死因子受体超家族中的一个亚家族。Fas、TNFR1、DR3、DR4是目前研究比较清楚的死亡受体。由Fas-Fas-L和TNFR为代表介导的细胞凋亡通路研究最多。

脑缺血后神经细胞受到缺血等一系列刺激后，细胞表面的Fas配体(Fas ligand，FasL)、TNF配体(tumor necrosis factor α，TNFα)分别与相应的受体(FasR，TNFR1)结合，使受体相互交联形成三聚体并激活，通过死亡效应域(death effect domain，DED)结合Fas相关死亡域蛋白(Fas -associated protein with death domain，FADD)和 Procaspase-8形成死亡诱导信号复合物(death-inducing signaling complex，DISC)，该死亡诱导信号复合物导致Caspase-8被活化，激活的Caspase-8启动蛋白酶级联反应，从而活化下游的效应酶Caspase，诱导Fas介导的细胞凋亡［4］。

1.2 Caspase非依赖性凋亡通路 脑缺血后，DNA发生损伤，大量表达多聚ADP核糖聚合酶-1(poly ADP-ribose polymerase-1，PARP-1)，PARP-1催化生成多聚ADP核糖(Poly ADP-ribose，PAR)，PAR进入线粒体使线粒体释放凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)并转位进入核内，导致染色质浓缩和DNA降解，形成PARP-1过度表达的恶性循环;当细胞接受凋亡信号刺激后，Bcl 2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/ adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 3，BNIP 3)同源二聚体和线粒体外膜结合，使MPTP开放，导致线粒体内的核酸内切酶G(endonuclease G，EndoG)被释放并转移至核内。同时，在细胞核内AIF和Endo G相互作用，导致DNA断裂和染色质凝聚，从而导致不依赖Caspase的细胞凋亡［5］。总之，这 3条信号转导通路都是通过caspase-3完成最终的激活。其中线粒体介导的细胞凋亡通路作为经典的凋亡通路，近年来受到人们的广泛关注。

2 细胞凋亡相关基因的表达

细胞凋亡受多种基因调控，包括Bcl-2家族基因、Caspase-3基因、p53基因、Fas基因、热休克蛋白(heat stock protein，HSP)基因、即早基因(immediate-early genes，IEGs)等［6］。

2.1 Bcl－2基因家族在缺血性脑损伤中的表达

2.1.1 Bcl-2在缺血性脑损伤中的表达 B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2)是从滤泡性淋巴瘤中分离出来的细胞凋亡信号转导通路中最重要的凋亡抑制基因。凋亡抑制基因Bcl-2高表达能抑制MPTP的开放，阻止细胞色素C及促凋亡相关蛋白释放到线粒体膜外，从而抑制caspase-3的激活，导致各种因素诱导的细胞凋亡。Bcl-2还能通过抑制氧自由基结合Bax蛋白，从而抑制细胞凋亡。

崔芳琴等［7］通过建立脑缺血再灌注模型，观察不同缺血时间的小鼠脑组织免疫组织化学染色切片，证实了在脑缺血早期受损神经元内，Bcl-2表达上调。但是随着缺血时间进一步延长，Bcl-2表达进一步减少，为临床上使用Bcl-2激动剂治疗脑缺血提供依据。

2.1.2 Bax在缺血性脑损伤中的表达 Bax是最早发现的促凋亡基因，正常情况下，胞质中的Bax以单体形式存在。在凋亡信号诱导下，胞质中的Bax以无活性的单体形式转移至线粒体，与线粒体膜结合使其构型发生改变，形成异源二聚体复合物，使线粒体通透性发生改变，开放线粒体通透转换孔，释放凋亡因子如细胞色素C等，细胞色素C与AIF及procaspase-9结合形成“凋亡小体”，从而启动细胞凋亡级联反应［8］。

高红莉等［9］通过建立大鼠脑缺血再灌注模型，研究血府逐瘀汤对脑缺血再灌注大鼠皮质神经细胞凋亡的影响。结果显示，模型组与假手术组比较，大鼠脑组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达显著增加，血府逐瘀汤大、中、小剂量给药组大鼠脑组织中Bax、Caspase-3 mRNA的表达量较模型组明显降低，而Bcl-2 mRNA表达较模型组明显升高。提示血府逐瘀汤可能通过下调神经细胞Bax、Caspase-3 mRNA的表达，上调Bcl-2 mRNA的表达，抑制细胞凋亡。

2.2 Caspase在缺血性脑损伤中的表达 Caspase-3是细胞凋亡信号通路中最关键的效应酶，在神经细胞凋亡级联反应中处于核心位置。各种因素引起的细胞凋亡都是通过 caspase-3完成最终激活的。在正常细胞中Caspase-3合成后以酶原和无活性的形式存在，当细胞发生凋亡时，激活的Caspase-3可以使一系列NF-κB、结构蛋白及多聚ADP核糖聚合酶活化，形成凋亡小体和DNA片段化，从而介导细胞凋亡。

有研究发现，在脑缺血再灌注模型组 Caspase-3 mRNA表达明显高于假手术组，凋亡细胞显著增多;与模型组比较，天麻素大、中、小剂量组和尼莫地平组Caspase -3 mRNA表达明显降低，提示天麻素可通过下调Caspase-3 mRNA的表达，抑制神经细胞凋亡，从而有效地保护脑缺血。张曼等［10］研究结果显示，缺血再灌注模型组Caspase-3蛋白表达较假手术组显著增加;菟丝子黄酮50mg/kg、l00mg/kg剂量组和尼莫地平组Caspase-3蛋白的表达较缺血再灌注模型组显著减少。提示菟丝子黄酮可以通过下调Caspase-3蛋白的表达，从而抑制神经细胞凋亡。

2.3 p53在缺血性脑损伤中的表达 p53是一种与肿瘤密切相关的抑癌基因，包括野生型p53和突变型p53。野生型p53是促凋亡基因，它可以直接导致细胞凋亡，也可以通过激活一系列下游基因间接导致细胞凋亡。当细胞发生凋亡时，p53能通过上调促凋亡基因，下调抗凋亡基因，在缺血性脑损伤中发挥重要作用。

许妍妍等［11］发现在缺血再灌注后2 h，p53表达的阳性细胞数微量增多，3 h后略有增多，6 h后显著增多，并持续增多至12 h。RT-PCR结果显示，假手术组中p53 mRNA仅有微量表达，在缺血2～3 h大鼠脑组织中p53 mRNA仅有微量表达，6 h表达显著增多，并持续增多至12 h。

2.4 IEGs在缺血性脑损伤中的表达 即早基因(immediate-early genes，IEGs)是一类对外界刺激信号传入数分钟内即刻作出反应进行表达的基因。在正常情况下，c -fos低水平表达。当细胞发生凋亡时，Fos蛋白由胞质转入细胞核内，通过和Jun蛋白相互作用形成异源二聚体转录因子复合物(activator protein 1，AP-l)，使其与DNA结合位点特异性结合，从而调控靶基因快速而短暂的表达［12］。

陈江君等［13］通过观察不同缺血时间的大鼠脑组织免疫组织化学染色切片发现，假手术组阳性细胞数仅有微量表达;模型组海马CA1区c-fos阳性细胞数在缺血灌注3 h表达显著增加，48 h达高峰，72 h仍有表达;红景天干预组c-fos阳性细胞数较同时相模型组比较明显降低。

2.5 Fas在缺血性脑损伤中的表达 Fas是重要的促调亡基因。一方面，FasL与Fas两者结合，使Fas死亡区交联，产生神经酰胺，通过某种途径，激活内源性核酸内切酶，引起凋亡。另一方面，FasL与FasR结合，使受体相互交联形成三聚体并激活，通过DED结合Fas相关死亡域蛋白(Fas-associated protein with death domain，FADD)和Procaspase-8形成死亡诱导信号复合物，该死亡诱导信号复合物导致Caspase-8被活化，从而活化下游的效应酶Caspase，诱导Fas介导细胞凋亡。

实验发现川芎嗪可通过下调脑缺血再灌注诱导的Fas-L蛋白表达，从而抑制神经细胞凋亡。通过观察不同缺血时相大鼠脑组织免疫组织化学染色切片发现，缺血再灌注组大鼠脑组织神经细胞凋亡数目及Fas蛋白阳性细胞数目较假手术组显著增多;Fas蛋白阳性细胞数目在缺血再灌注后6 h达高峰，24 h开始下降，细胞凋亡数目在缺血再灌注6 h显著增加，24 h达高峰，36 h略有下降［14］。

2.6 HSP在缺血性脑损伤中的表达 热休克蛋白(heat stock protein，HSP)是一组进化上高度保守的细胞内可溶性蛋白。HSP70在脑缺血损伤研究中备受关注。正常情况下，HSP70 mRNA在脑内表达稳定，但很快被降解;应激状态下，其他蛋白合成受到抑制，HSP70表达反而增强，敲除HSP基因后，HSP表达下降，细胞凋亡增多。

研究发现，模型组与假手术组比较，大鼠脑组织中HSP70 mRNA及其蛋白表达明显增多，通心络治疗组HSP70 mRNA表达较模型组显著增多。提示通心络可以促进应激保护性蛋白 HSP70表达，从而抑制细胞凋亡［15］。

综上所述，脑组织缺血缺氧后会引发一系列的病理改变，其中有关缺血所引发的神经细胞凋亡在近些年来的研究中备受关注。脑缺血后的神经细胞凋亡是一个复杂的瀑布式级联反应，这些凋亡调控因子之间相互协同或相互制约，共同构成一种复杂的网络系统共同完成对细胞凋亡的调控。然而细胞凋亡所涉及的传导通路和分子机制尚不清楚，因此，对这些凋亡调控因子进行系统深入的研究，将利于我们进一步探索神经元损伤的作用靶点和作用机制，为临床应用提供理论依据。

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2015-11-10)

国家自然科学基金(81160560)

杨玉梅